乳腺癌组织中微淋巴管分布及密度的临床病理意义

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1、1乳腺癌组织中微淋巴管分布及密度的临 床病理意义作者：张宇 宋吉宁 周为 黎卫平 马岚 【摘要】 目的 探讨乳腺癌组织中微淋巴管分布、密度及其与相关临床病理因素之间的关系, 分析乳腺癌淋巴结转移的可能机制。方法 应用免疫组化 SABC 法检测 50 例乳腺癌及其相应癌旁正常乳腺组织中 D2-40 的表达，并分别计数其微淋巴管密度（microlymphatic density，MLD）。结果 乳腺癌组织中的 MLD 明显高于癌旁正常组织(P0.01)，且肿瘤不同区域中 MLD 有所差异，肿瘤边缘区 MLD均值显著高于癌旁正常组织及肿瘤中心区均值(P0.01)；肿瘤中心区 MLD 与正常组织 ML

2、D 无显著性差异(P0.05)；肿瘤边缘区 MLD 与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移状态相关(P0.01)，与年龄、肿瘤大小、组织分型及雌、孕激素受体状态无关(P0.05)。结论 1)乳腺癌组织中存在淋巴管，且分布存在异质性，淋巴管主要分布于肿瘤边缘区，肿瘤边缘区 MLD 与淋巴结转移、临床分期状态相关，其 MLD 的增加可能与乳腺癌的侵袭及转移相关；2)乳腺癌组织中的 MLD 检测可作为评估乳腺癌淋巴结转移状况的一项辅助指标，为判断乳腺癌患者预后及确定临床治疗方案提供实验和理论依据。 【关键词】 乳腺癌 D2-40 MLD 淋巴结转移 免疫组织化学Abstract Objective To i

3、nvestigate the characteristics of distribution and density of lymphatic vessel and the correlation with its clinicopathological factors in breast cancer and analyse the possible mechanism of lymph node metastasis in breast carcinoma. Methods Making use of immunohistochemistry to research the express

4、ion of D2-40 in 50 cases of breast carcinoma and the normal tissues near the tumor 2borderline,which microlymphatic density was counted. Results The MLD in breast carcinoma was significant higher than that in the normal tissue adjacent carcinoma(P0.01) and it was not the same in different aeras of c

5、arcinoma .The MLD in tumor borderline was higher than that in the normal tissues and tumor center tissues (P0.01)and There was no correlation in the tumor center and the normal tissue (P0.05). The MLD in the borderline had positive relation to the clinical stage, and lymph node metastasis (P0.01), b

6、ut it had no significant difference from age,tumor diameter,histologic types , progestoger and estrogen receptor condition (P0.05). Conclusions 1. The lymphatic vessel appears in the breast carcinoma. It mainly distributes in the tumor borderline. The MLD in the tumor borderline has correlation with

7、 clinical stage ,lymph node metastasis. The increase of MLD may be related to the invasion and metastasis of breast carcinoma in the tumor borderline.2. The detection of MLD in the tissue of breast carcinoma can be a important affiliated markers to evaluate the lymph node metastasis. It also can mea

8、sure the prognosis of breast carcinoma and provide experimental and theoretical foundation to confirm the clinical treatment methods.Key words Breast carcinoma D2-40 Microlymphatic density Lymph node metastasis Immunohistochemistry肿瘤细胞经淋巴道转移是人体上皮源性恶性肿瘤的早期扩散主要途径之一。但由于缺乏淋巴管特异性标记物，对肿瘤淋巴管转移的研究相对滞后。肿瘤内是否

9、存在淋巴管，肿瘤内淋巴管生成是否与淋巴道扩散转移有关？目前对此存在争议1,2。乳腺癌局部淋巴结转移十分常见，是影响预后的关键因素之一，一旦出现淋巴结转移，其患者生存率明显降低。为此本实验选取 50 例乳腺癌及其相应癌旁正常乳腺组织标本，应用免疫组化 SABC 法采用新近发现的淋巴管特异性标记物 D2-40 抗体，对乳腺癌和癌旁正常乳腺组织淋巴管进行染色标记，并计数其微淋巴管密度（microlymphatic density，MLD），以此来探讨乳腺癌组织中的 MLD 特点及其与乳腺癌相关病理因素间的关系，并探讨 MLD 与淋巴结转移的关系和可能的机制，为乳腺癌的临床治疗及预后判断提供一定的理论

10、依据。1 材料与方法1.1 标本3收集青海大学附属医院病理科 2004 年 11 月2005 年 10 月手术切除的乳腺癌及相应癌旁正常组织石蜡包埋标本 50 例。患者均为女性病例，年龄 3372 岁，平均 545 岁，其中50 岁者 27 例，50 岁者 23 例；根据 2003 年 WHO 制定的乳腺癌病理学分类标准进行病理组织学分类和 TNM 分期：浸润型导管癌 35 例，导管内癌 13 例，小叶原位癌 2 例；肿瘤2 cm 者 24 例，2 cm 者 26 例；伴有淋巴结转移者 27 例，无淋巴结转移者 23 例；期者 28 例，期者 22 例。所有病例术前均未接受放疗和化疗。所有标本

11、经 10福尔马林液固定后制成切片（4 m），切片贴于多聚赖氨酸处理过的玻片上。每个蜡块切片 5 张，然后行常规 HE染色及免疫组织化学 SABC 法染色。1.2 试剂即用型鼠抗人 D2-40 单克隆抗体(产品编号为 ZM-0465)购自北京中杉金桥生物工程有限公司。即用型鼠抗人 ER 单克隆抗体(产品编号为 MAB-0062)、即用型兔抗人 PR 单克隆抗体(产品编号为 RMA-0502)、即用型鼠抗人 C-erbB-2 单克隆抗体(产品编号为 MAB-0198)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。SABC 试剂盒、DAB 显色试剂盒及 PBS 缓冲液结晶、柠檬酸修复液结晶均为 Maixin-

12、bio 公司产品，购自武汉博士德生物工程有限公司。1.3 免疫组织化学染色方法采用 SABC 法，并设阳性、阴性对照。1.4 结果判定方法41.4.1 阳性染色反应分级判断标准ER、PR 为胞核着色，C-erbB-2 为胞膜/胞浆着色。免疫组化染色结果判定参照邢传平等3相关文献：以低倍镜和高倍镜分别观察切片，阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰，细胞浆或细胞核有棕黄色颗粒沉着，染色明显高于背景者。根据细胞百分率及染色深浅分级：1)阳性细胞百分率：无细胞显色为 0 分；25的细胞显色为 1 分；2550的细胞显色为 2 分；50的细胞显色为 3 分。2)显色深浅不一或显色不清为 0 分；浅黄色为 1

13、分；棕黄色为 2 分；深褐色为 3 分。综和评分：01 分为阴性(-)；23 分为弱阳性(+)；45 分为中度阳性(+)；5 分为强阳性(+)。ER、PR、C-erbB-2 的免疫组化染色结果判定均参照以上标准。 本课题在进行数据处理时将+、 +、+合并为阳性(+)作统计分析。1.4.2 淋巴管判定及 MLD 计数方法1.4.2.1 淋巴管判定标准：在淋巴管内皮细胞胞膜和胞浆的 D2-40 阳性染色呈棕黄色颗粒状。标记阳性淋巴管一般呈扩张状，形态不规则，壁薄，管壁无平滑肌，管腔内偶见淋巴细胞，也可见由几个内皮细胞构成的细胞簇状，甚至仅见单个内皮细胞。1.4.2.2 计数方法：D2-40 特异性

14、地表达于淋巴管，参照 Masakazu 等4的方法对乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织 MLD 计数，把 D2-40 染色呈阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇分别计为一个阳性微淋巴管。乳腺癌组织先在低倍镜视野下分别选取肿瘤边缘(肿瘤浸润边缘区)和肿瘤中心区中脉管最丰富的区域（即“hot spot”），再在 200 倍（0.74mm2）视野下分别计数微淋巴管数目，每例计数 3 个视野，5以其均值作为该病例 MLD 密度。癌旁正常乳腺组织选择阳性染色脉管最丰富区，在 200 倍视野下计数微淋巴管数目，每例计数 3 个视野，并求其均值。1.5 统计学处理采用 SPSS11.0 统计软件对数据进行统计学处理

15、。所有计量数据均以均数标准差（xS）表示，显著性检验采用单因素方差分析或 t 检验。检验水准以 P0.05为具有显著性差异；P0.01 为具有非常显著性差异。2 结果2.1 乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中 D2-40 的表达D2-40 阳性染色仅定位于淋巴管内皮细胞胞膜和胞浆，呈棕黄色颗粒状(见图 1)。癌旁正常乳腺组织中 D2-40 阳性染色淋巴管多呈扩张状，形态不规则，壁薄，管壁无平滑肌，管腔内偶见淋巴细胞，也可见呈闭锁的条索状或几个内皮细胞构成的细胞簇，甚至单个内皮细胞。乳腺癌组织内可见明确的 D2-40 阳性淋巴管(见图23)，也有部分乳腺癌组织内淋巴管相当稀疏甚至完全缺乏。乳腺癌组织中淋

16、巴管数目和分布具有明显的异质性，表现为：数目的差异：肿瘤边缘区中微淋巴管数最多(见图 4)，MLD 均值为 56.413.5，肿瘤中心区 MLD 均值为 13.27.2，肿瘤边缘区与肿瘤中心区 MLD 均值间差异有统计学意义（P0.01）；形态的差异：肿瘤边缘区可以见到较多管腔扩张的淋巴管，而肿瘤中心区多为闭锁的条索状(见图 5)。50 例乳腺癌总的 MLD 均值为 34.57.5，其相应癌旁正常乳腺组织 MLD 均值为 15.07.8，两组 MLD 均值间差异有统计学意义（P0.01），肿瘤边缘区MLD 均值与癌旁正常乳腺组织差异有统计学意义（P0.01），但肿瘤中心区6MLD 均值与癌旁正常组织差异无统计学意义（P0.05），见表 1。表 1 癌旁正常乳腺、乳腺癌组织中淋巴管密度测定比较2.2 乳腺癌 MLD 与乳腺癌临床病理因素间的关系50 例乳腺癌总的 MLD 与各临床病理因素间差异无统计学意义，乳腺癌不同区域的 MLD 与各临床病理因素间差异有统计学意义