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1、1不同浓度游离脂肪酸对大鼠系膜细胞外 基质基因表达的影响作者：魏明 卢永申 张俊峰 李盼盼【摘要】 目的 探讨不同浓度游离脂肪酸（FFAs）对大鼠系膜细胞外基质基因表达及合成分泌的影响。方法 以体外培养大鼠系膜细胞为基础，采用逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术检测型胶原（Col）、纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子（TGF 1）mRNA 的表达；采用酶联免疫吸附 ELISA）试验法检测培养系膜细胞上清液 Col、FN 的水平。 结果 25、100、400 mol/L 软脂酸（PA）刺激组Col、FN、TGF 1 mRNA 的表达分别为（0.990.18、1.240.16、1.380.21）
2、、（0.910.13、1.140.12、1.280.11）和（1.210.09、1.430.07、1.540.06），与 0 mol/L 对照组比较（0.610.17、0.620.08、0.810.10），差异有统计学意义（均P0.01）；25、100、400 mol/L PA 刺激组 Col、FN 的分泌分别为（59.976.48、67.246.86、74.387.21）ng/ml 和（100.917.13、135.048.12、154.189.11）ng/ml，与 0 mol/L 对照组比较（48.846.17、88.688.08）ng/ml，差异有统计学意义（均 P0.01）。结论 FF
3、As 具有促进系膜细胞外基质基因表达和分泌的作用，可能在肾小球硬化病理过程中发挥着重要作用。 【关键词】 脂肪酸；型胶原；纤维连接蛋白；转化生长因子分别采用逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）技术和酶联免疫吸附（ELISA）试验法对系膜细胞外基质型胶原(Col)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子1（TGF 1）mRNA 表达和体外培养合成分泌水平进行检测，旨在探讨不同浓度游离脂肪酸（FFAs）对系膜细胞外基质 Col、FN、TGF 1 mRNA 表达的影响以2及其在肾小球硬化发病机制中的作用。1 材料与方法1.1 材料RPMI 1640 培养基及新生小牛血清（FCS）为美国 Gibco 产品
4、，软脂酸（PA）及小牛血清蛋白（d BSA）为美国 Sigma 产品。1.2 细胞培养大鼠肾小球系膜（HBZY 1）细胞购于郑州大学生理教研室，用含10FCS、100 U/ml 青霉素及 100 g/ml 链霉素的 RPMI 1640 培养液制成单个细胞悬液，接种于 100 ml 培养瓶内。当 HBZY 1 细胞长至 80融合时，用 0.25胰蛋白酶消化传代，取第 1114 代 HBZY 1 细胞用于实验。37 5CO2 100%湿度条件下培养 24 h,使细胞处于对数生长期，换成 0.5 FCS RPMI 1640 培养液培养 24 h 使细胞处于静止期。1.3 实验分组吸出孔内培养液，加入
5、 PA 使终浓度分别为 25、100、400 mol/L d BSA，实验重复 3 次。1.4 RT PCR 体系按上述方法分组给药，HBZY 1 细胞继续培养 72 h，PBS 冲洗 3 次，加入 1 ml Trizol RNA 提取液，提取细胞总 RNA。根据 A260/A280 值计算总 RNA 浓度。Col、FN、TGF 1 mRNA 的引物序列见表 1。引物由上海生物工程公司合成。在 25 l 的反应体系中含引物各 10 pmol/L，2.5l 的 10buffer，1 mmol/L 3dNTP，1l Taq 酶，变性 94 1 min，退火 57 1 min，延伸 72 1 min
6、，35 个循环，72延伸 2 min。表 1 Col、FN、TGF 1 mRNA 引物序列（略） 1.5 PCR 扩增产物电泳取扩增产物 5 l 加载样缓冲液 1 l，在含有 0.5 g/ml 溴化乙啶的 2琼脂糖凝胶中电泳，标准物为 DL2 000 Marker。通过法国紫外凝胶成像系统分析电泳带灰度。1.6 ELISA 法检测培养上清液 Col、FN 含量将 5104/ml HBZY 1 细胞接种于 24 孔微量板中培养 24 h，使细胞处于对数生长期，换成 0.5FCS RPMI 1640 培养液培养 24 h 使细胞处于静止期。加入软脂酸 1 ml 使终浓度分别为 25、100、400
7、 mol/L d BSA，继续培养 72 h，实验重复 3 次。1.7 统计学处理数据以 xs 表示。对于正态分布的变量应用单因素方差分析，偏相关分析用于在其他变量固定的条件下某两个相关变量相关分析的检验；所有统计学处理均使用 SPSS10.0 软件进行。2 结果2.1 不同浓度 PA 刺激对 HBZY 1 细胞 Col、FN、TGF 1 mRNA 表达的影响以 25、100、400mol/L PA 刺激后，Col、FN、TGF 1 mRNA 表达量均明显升高，与 0 mol/L 对照组比较差异有统计学意义（P0.01）。Col、FN、TGF 1 4mRNA 表达量间两两比较差异有统计学意义（
8、均 P0.05）。HBZY 1 细胞Col、FN、TGF 1 mRNA 表达量呈浓度依赖性升高，见图 1 和表 2。表 2 不同浓度 PA 对 HBZY 1 细胞 Col、FN、TGF 1 mRNA 表达的影响(略)2.2 不同浓度 PA 刺激对 HBZY 1 细胞 Col、FN 分泌水平的影响以 25、100、400 mol/L PA 刺激后，Col、FN 分泌水平均明显升高，与 0 mol/L 对照组比较差异有统计学意义（P0.01）。Col、FN 分泌水平间比较差异有统计学意义（P0.05）。 PA 促进 HBZY 1 细胞合成分泌 Col、FN，并具有浓度依赖性。见表 3。表 3 不同
9、浓度 PA 对 HBZY 1 细胞 Col、FN 分泌的影响(略)3 讨论细胞外基质（FN、Col、TGF 1）是细胞生存的微环境，广泛存在各种细胞表面，是构成基底膜的主要成分。在人体的发育、细胞分化与迁移、信号传导等生理过程和炎症损伤与修复、免疫应答以及肿瘤转移病理过程中具有重要功能和作用1。长期以来，细胞一直是生物界研究疾病的重点。近年来，细胞外基质在疾病的发生中所起的作用越来越受到重视。FFAs 与肾小管间质损伤密切相关，是慢性肾脏疾病的一个进展因素。Kamijo 等2报道 FFAs 能导致肾小管间质损伤。在肾病综合征不是由于白蛋白而是由于结合了 FFAs 的白蛋白引起了肾小管损伤3。T
10、homas 等4通过大鼠模型研究发现，白蛋白结合 FFAs 组在巨噬细胞浸润、细胞凋亡和皮质细胞增殖方面均比白蛋白未结合组显著。本研究结果显示，不同浓度 PA 刺激 HBZY 1 细胞后，Col、FN、TGF 1 mRNA 表达量均明显升高，并呈浓度依赖性。提示 PA 能促进系膜细胞外基质基5因的表达。同时还显示 HBZY 1 细胞合成分泌 Col、FN 水平也显著增加，并呈浓度依赖性，表明 PA 能促进系膜细胞蛋白质的合成。提示 FFAs 可能是肾小球硬化的一个诱导因素。总之，在生理情况下肾小球内细胞外基质的合成和降解保持动态平衡，以维持正常的生理功能。当某些病理因素（糖尿病、肾病等）致 F
11、FAs 增多，导致细胞外基质合成增加或降解减少，造成细胞外基质成分积聚，使细胞外基质的大量堆积引起肾小球硬化发生、发展。【参考文献】1 潘琳，李光伟，郭艳茹，等.细胞外基质纤维连接蛋白和层黏连蛋白在糖尿病大鼠 DR 微血管病变表达的研究J.中华糖尿病杂志，2004；12（1）:56 8.2 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid bound to albumin aggravate tubulointerstitial damageJ.Kindney Int，2002；62（12）:1628 37.3 Kamijo A，Sugay
12、a T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid binging protein as a new clinical marker for the progression of chronic renal diseaseJ. Rinsho Byori，2003；51（2）：219 24.4 Thomas ME，Harris KP，Walls J,et al.Fatty acid exacerbate tubulointerstitial injury in protein over load proteinuriaJ.Am J Physiol Renal Physiol,2002；283（10）:F640 7.
