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1、1乳腺癌患者血浆循环 DNA 含量分析及其 临床意义【摘要】 目的: 检测乳腺癌患者血浆循环 DNA 含量, 探讨其与临床病理特征之间的关系。方法: 收集 80 例乳腺癌、 40 例乳腺良性病变患者和 97 例健康自愿者的外周血。用微量基因组 DNA 提取试剂盒提取血浆 DNA, 用荧光染料试剂盒和QubitTM 荧光仪测定血浆 DNA 含量。结果: (1)血浆循环 DNA 含量在组织学分级级和级、 患者肿瘤直径20 mm 和20 mm 之间有统计学差异(P0.05); 而在淋巴结转移阴性和阳性、 雌激素受体阴性和阳性之间均无统计学意义。(2)乳腺癌组血浆循环 DNA 浓度明显高于乳腺良性病变
2、组和正常对照组, 相比较有统计学差异(P0.05); 而良性病变组血浆循环 DNA 浓度高于正常对照组, 但差异无统计学意义。(3)以血浆循环 DNA12.90 g/L 作为诊断乳腺癌的临界值, 其检测灵敏度为 85.0%, 特异度为 88.3%, 准确度为 87.1%。(4)Roc 曲线下面积(AUC)为 0.879, 95%可信区间为 0.8300.928。结论: 乳腺癌患者的血浆DNA 水平与疾病的发生、 发展和预后密切相关, 血浆 DNA 水平有助于乳腺癌的鉴别诊断。 【关键词】 乳腺肿瘤; 血浆; 循环 DNA随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的深入研究, 以及分子生物学检测技术的
3、快速发展, 外周血肿瘤标记由于检测的方便和非侵入性, 己逐步替代了受到标本采集以及无法连续监测和随访追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记。而外周血循环 DNA 及其改变的分子生物学检测正以其不可替代的优点逐渐被人们所重视, 并成为肿瘤细胞生物学及分子生物学研究中引人注目的一个亮点1。近年来, 日2益增多的研究表明, 肿瘤在生长过程中能持续释放肿瘤细胞 DNA 进入外周血液, 健康人体的血清及血浆中只含有极少量的循环 DNA, 在炎症及肿瘤患者外周血中循环 DNA 的浓度增加, 伴有转移的肿瘤患者其浓度更高于早期患者2。目前研究显示多种恶性肿瘤患者的血浆循环 DNA 含量增加, 而且这些 DNA 具有
4、与肿瘤组织中 DNA 相同的基因特性3。因此, 我们对乳腺癌患者血浆循环 DNA 水平进行研究, 为血浆循环 DNA 在乳腺癌的诊治中的作用提供理论依据。1 资料和方法1.1 一般资料 2007-09/2008-06 本院收治的乳腺癌患者 80 例, 均有详细病理资料。年龄 374(平均 56.168.38)岁; 组织学分级级 37 例, 43 例; 肿块20 mm 者 45 例, 肿块20 mm 者 33 例; 淋巴结阴性患者 37 例; 淋巴结阳性者 43 例; 雌激素受体( ER )阳性者 36 例, ER 阴性者 44 例。并选择年龄匹配的 40例乳腺良性病变患者和 97 例健康自愿者
5、作为对照组。1.2 方法1.2.1 样本收集 所有乳腺癌患者在接受治疗前, 采集患者晨起空腹, 抽取 5 mL 静脉血, 置于盛有促凝剂试管中, 放置 4冰箱保存并在 6 h 内处理。用低温离心机 4 3 000 r/min 离心 15 min 后, 用无菌的 Eperdoff 管吸取 15 L 在高倍显微镜下观察无细胞及细胞碎片残留为合格标本, 放入 1.5 mL 无菌 EP 管中放-80度的低温冰箱保存备 DNA 抽提。相同方法采集保存乳腺良性病变、 健康自愿者的血液样本。1.2.2 血浆 DNA 的提取和纯化 用微量基因组 DNA 提取试剂盒(QIAamp 3DNA Blood Mini
6、 Kit, Qiagen)提取血浆 DNA。方法按试剂盒中说明进行, 取 200 L 血浆加入 20 L 蛋白酶和 200 L 裂解液, 充分混匀后, 56温浴 10 min, 加250 L 无水乙醇, 柱离心法纯化回收 DNA, 用 80 L buffer AE 洗脱。1.2.3 血浆 DNA 定量 取 20 L 纯化的血浆 DNA, 与 180 L 含荧光染料的工作液(Quant iTTM dsDNA HS 试剂盒提供)混匀, 取 10 L 该试剂盒提供的标准品与 190 L 工作液混匀, 室温放置 2 min, 用 QubitTM 荧光仪测定标准品及样品, 根据标准曲线换算出样品中的 D
7、NA 含量。1.2.4 统计学分析 所有计量资料采用 xs 表示, 统计处理先用 F 检验, 再行q 检验。配对资料采用配对 t 检验。数据分析采用 SPSS13.0 统计分析软件, P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 乳腺癌临床病理学各参数之间血浆循环 DNA 含量的比较 血浆循环 DNA含量在组织学分级级和级、 患者肿瘤直径20 mm 和20 mm 之间有统计学差异(P0.05); 而在淋巴结转移阴性和阳性、 雌激素受体阴性和阳性之间均无统计学意义(表 1)。2.2 三组血浆循环 DNA 水平的检测 乳腺癌组血浆循环 DNA 水平显著高于乳腺良性病变组和正常对照组, 相比较有统
8、计学差异(P0.05); 而良性病变组血浆循环 DNA 水平高于正常对照组, 但差异无统计学意义(表 2)。2.3 血浆循环 DNA 诊断性试验的敏感性与特异性分析 80 例乳腺癌患者血浆4循环 NDA 测定结果, 结合 137 例对照(97 例正常对照组和 40 例良性病变组)数据, 取不同临界值, 计算其相应的灵敏度和特异度。结果提示, 以血浆循环DNA12.90 g/L 作为诊断乳腺癌的临界值, 其检测灵敏度为 85.0%, 特异度为88.3%, 准确度为 87.1%, 诊断效果最好(表 3)。表 1 乳腺癌临床病理学各参数之间血浆循环 DNA 含量的比较表 2 三组血浆循环 DNA 浓
9、度比较表 3 不同临界值血浆循环 DNA 诊断乳腺癌的灵敏度和特异度2.4 受试者工作特征曲线(ROC 曲线) 用真阳性率和假阳性率作图所得曲线, 它可表示灵敏度和特异度之间的相互关系, 曲线上的每一点代表了随着病例诊断阈值或置信阈变化的灵敏度与特异度。Roc 曲线下面积(AUC)可反映诊断试验的准确性大小, 计算图 1 的 AUC 为 0.879, 95%可信区间为 0.8300.928, 表明血浆循环 DNA 定量分析对乳腺癌具有较好的诊断价值。 3 讨论有关乳腺癌血浆循环 DNA 含量与传统的临床病理学预后因素的研究仍然不能明确这一指标是否具有独立预测预后的价值, 因此, 众多学者把循环
10、 DNA 含量作为辅助因素与临床病理学参数结合起来分析。研究认为组织学分级与 DNA的含量有关4, 我们实验结果表明乳腺癌级血浆循环 DNA 含量显著高于级(P0.05), 随着循环 DNA 含量增高, 肿瘤的分化程度越差, 组织学分级越高。本研究结果显示, 肿瘤直径20 mm 的血浆循环 DNA 含量明显高于20 mm(P0.05), 由于肿瘤大小反映了肿瘤的年龄, 表明循环 DNA 含量在乳腺肿瘤形成的早期浓度较低。因此, 循环 DNA 的检测不仅可以为组织学分级提供客观依据, 同时作为 1 项与组织学分级相关的预后指标, 循环 DNA 含量的检测具有更高的敏感性5。5健康人体的血清及血浆
11、中只含有极少量的循环 DNA, 在炎症及肿瘤病人中外周血循环 NDA 的浓度增加6。本研究中乳腺癌患者血浆循环 DNA 水平显著高于乳腺良性病变及健康对照组, 而乳腺良性疾病的血浆循环 DNA 水平与健康对照组间无统计学差异, 提示良性病变虽然存在细胞增生, 但对血中循环 DNA 影响并不明显。乳腺癌血浆循环 DNA 作为诊断性试验的敏感性与特异性分析表明, 以血浆循环 DNA 浓度12.90 g/L 作为诊断乳腺癌的临界值, 其检测灵敏度为85.0%, 特异度为 88.3%, 准确度为 87.1%。ROC 曲线分析结果显示, 高血浆循环DNA 水平与乳腺癌变间具有较强的关联, 提示血浆循环
12、DNA 检测对于乳腺癌诊断具有较高价值。不论是临床病理学指标还是循环 DNA 含量均可反映乳腺癌的生物学特征, 在预测乳腺癌预后方面均具有各自不同的优点, 但仅仅选用 1 种预后指标却无法揭示出肿瘤的本质特征。但血浆循环 DNA 检测方法与病理学手段相比, 血浆是一种易得的标本, 且无创伤性, 诊断价值高。因此, 通过血浆循环 DNA 检测诊断乳腺癌具有一定的优越性, 值得临床应用。【参考文献】1 詹文青, 陈 华. 肿瘤患者外周血循环 DNA 的研究及其意义J. 2008, 12(3): 274-276.2 Pathak AK, Bhutani M, Kumar S, et al. Circ
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