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1、1三七皂甙单体 Rg1 对失血性休克大鼠肠 上皮细胞线粒体功能影响的研究作者：李伟文，方传勤，陆松敏，刘建仓，郭素清，程凤，王正国【摘要】 目的 观察三七皂甙单体 Rg1 对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体细胞色素氧化酶（COX）活性及膜电位的影响。方法 健康 Wistar 大鼠 24 只，随机等分为 4 组：正常对照组(N)、失血性休克 5 小时组(HS)、单纯复苏对照组(RE)、复苏加 Rg1 治疗组(Rg)，每组 6 只。采用荧光分光光度法检测线粒体膜电位;采用紫外分光光度法检测 COX 活性。结果 失血性休克 5 小时大鼠肠上皮细胞线粒体摄取 Rhodamine123 减少，即膜电位水平
2、显著降低（P0.01），单纯复苏组膜电位有轻微提高,复苏加 Rg1 治疗组线粒体膜电位明显提高,恢复到正常组水平。失血性休克 5 小时大鼠肠上皮细胞线粒体 COX 活性显著降低，单纯复苏后其活性仍然较低。复苏加 Rg1 治疗组 COX 活性较休克组比较有明显升高，并显著高于单纯复苏组。结论 复苏加 Rg1 可显著提高失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体 COX 活性及线粒体膜电位。Rg1 提高 COX 活性可能和提高该酶的产量和质量有关。 【关键词】 失血性休克；肠上皮细胞；三七皂甙单体 Rg1；细胞色素氧化酶；线粒体膜电位【Abstract】 Objective To study the effe
3、cts of Rg1 isolated from panax notoginseng saponins(PNS) on mitochondrial cytochrome oxidase(COX) and membrane potential of small intestinal epithelial cells in hemorrhagic shock rats.Methods Twenty four healthy Wistar rats were divided into 4 groups: control group(n=6),5 hour hemorrhagic shock grou
4、p(n=6),simple resuscitation group(n=6),and resuscitation plus Rg1 treatment group(n=6).COX activity was determined by ultraviolet spectrophotometer,and mitochondrial membrane potential(MMP) by 2fluorospectrophotometry.Results The COX activity was lowered markedly in hemorrhagic shock group compared
5、with the control group(P0.01),and increased more remarkably after treatment by PNS Rg1 compared with the shock group and the resuscitation group(P0.01).The mitochondrial membrane potential(MMP) was lowered more markedly in 5 hour hemorrhagic shock group compared with the control group(P0.01),and inc
6、reased more markedly after treatment by PNS Rg1 and then came back to normal level.The MMP increased higher in resuscitation group compared with the shock group(P0.01).Conclusion The mitochondrial COX activity and membrane potential can be increased markedly after treatment by PNS Rg1 compared with
7、the hemorrhagic shock group. PNS Rg1 may improve COX activity by increasing its production and quality.【Key words】hemorrhagic shock;intestinal epithelial cells；panax notoginseng saponins Rg1；cytochrome oxidase；mitochondrial membrane potential 能量代谢障碍，线粒体损伤是休克的重要成因。失血性休克后缺血低氧能使线粒体电子传递链上细胞色素氧化酶（cytochr
8、ome oxidase，COX）活性显著降低,线粒体呼吸功能也进行性下降。三七皂甙单体 Rg1 能显著提高失血性休克大鼠的存活率，使受损线粒体功能形态明显恢复，并能上调 COX和 COX基因的表达1。本实验观察 Rg1 对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体 COX 活性及膜电位的影响，为 Rg1 在失血性休克时保护线粒体的作用机制及缺血低氧性线粒体损伤的防治药物的研究提供理论基础。材料与方法1 动物分组与模型制作2健康 Wistar 大鼠 24 只，体重（25020）g,由第三军医大学野战外科研究所动物实验中心提供。随机等分为 4 组：正常对照组(N)、失血性休克 5 小时组(HS)、单纯复苏对照
9、组(RE)、复苏加 Rg1 治疗组(Rg)，每组 6 只。RE 组于失血性休克低血压维持 40mmHg 2 小时后，静脉给二倍失血量的平衡盐液；Rg 组于失血性休克低血3压维持 40mmHg 2 小时后，静脉给二倍失血量的平衡盐液和 Rg1（5mg/kg，体重），继续观察 3 小时。N 组除不放血外,其余处理同休克组。2 主要仪器和试剂配制2.1 主要仪器F 4500 荧光分光光度计（HITACHI），产地日本；组织研磨器（90MM），产地涿州。2.2 主要试剂及其配制肠上皮细胞线粒体分离液：临用前配制，取蔗糖 85.575g,Tris 1.2114g,EGTA（ethyleneglycol
10、bis N,N tetraacetic acid）0.7608g 溶于 900ml 水中，调节 pH 值至 7.6,定容至 1 000ml，保存于 4。肠上皮细胞线粒体反应递质（225mmol/L 蔗糖，20mmol/L KCl， 5mmol/L MgCl2，10mmol/L K2HPO4/KH2PO4，10mmol/L Tris HCl，1mmol/L EGTA，pH7.4）；称取 0.7701g 蔗糖、0.1864g KCl、0.0474g MgCl2、0.1576g Tris HCl、0.2282g K2HPO4、0.136g KH2PO4、0.0380g EGTA、0.1g BSA,加
11、双蒸水（ddH2O）溶解，调 pH7.5,定容至 100ml,保存于 4。临用时加入鱼藤酮,使其浓度为 5mol/L，加入琥珀酸钠,使其浓度为 5mmol/L。鱼藤酮、琥珀酸钠、细胞色素 C 及罗丹明 123（Rhodamine 123）购自 Sigma 公司。3 线粒体制备按文献所述方法并改进。用差速离心法获得线粒体。将线粒体悬浮在 1.5ml 分离递质中,卡马氏兰法测定蛋白含量,使蛋白浓度为 5mg/ml，用来测量线粒体膜电4位；再将线粒体蛋白浓度调整为 1mg/ml 测量 COX 活性。以上操作均在 04，2小时内完成。4 线粒体膜电位的检测根据文献2略有改进，以阳离子荧光染料 Rhod
12、amine123 为探针，通过线粒体摄取 Rhodamine123 后所引起递质中荧光值的变化来反映线粒体膜电位。步骤如下：肠黏膜细胞所分离的新鲜线粒体用 Bradford 法定蛋白(以 BSA 为参照)， 用线粒体反应递质调整线粒体蛋白浓度约 5mg/ml。2ml 线粒体反应递质中加入0.5nmol/L Rhodamine123，用 F 4500 荧光分光光度计(激发波长 500nm，发射波长 525nm)测量荧光基准值(F1)，再加入 100l 线粒体悬液，25孵育 15 分钟，5000g 离心 10 分钟，取上清测量其荧光值(F2)，以F=(F1-F2)线粒体蛋白量(mg)-1 来计算每
13、 mg 线粒体蛋白引起的荧光变化。5 细胞色素氧化酶(COX)活性测定3取 0.18mmol/L 细胞色素 C 0.5ml，加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)和过硫酸钠（Na2S2O4）摇匀，用分光光度计在 550nm 波长下测得 A 值，然后加入线粒体悬液 0.1ml(含蛋白 0.1mg)，立即开始计时，随后每隔 1 分钟测定 1 次 A 值，持续测定 5 分钟，最后加入饱和高铁氰化钾溶液 1 滴，使之完全氧化并记录结果。以最小二乘法计算，并经原点线求其斜率(K)值，即为细胞色素 C 氧化速率常数，代表COX 的活性(mol/min/mg Mt.Pro)。6 统计学处理各组数据用均数标准
14、差(s)表示，采用 t 检验和单因素方差分析检验各资料5的统计学显著性差异，P0.05 为差异显著,P0.01 为差异非常显著。用 SPSS 10.0 统计分析软件进行数据处理。 结果1 各组大鼠肠上皮细胞线粒体膜电位的的改变扫描电镜观察显示，差速离心法获得悬液中主要成分是线粒体。线粒体为圆形或椭圆形，有较完整的膜性结构，嵴排列整齐、致密(见图 1)。失血性休克 5 小时大鼠肠上皮细胞线粒体摄取 Rhodamine123 减少，即膜电位水平显著降低（P0.01），单纯复苏组膜电位有轻微提高,复苏加 Rg1 治疗组线粒体膜电位明显提高,恢复到正常组水平(见表 1) 。表 1 各组大鼠肠上皮细胞线
15、粒体摄取 Rhodamine123 的变化(略)2 各组肠上皮细胞线粒体 COX 活性的比较失血性休克 5 小时大鼠肠上皮细胞线粒体 COX 活性显著降低，单纯复苏后其活性仍然很低。 复苏加 Rg1 治疗组 COX 活性较休克组比较有明显升高，并显著高于单纯复苏组。讨论组织细胞缺血低氧时，线粒体呼吸、渗透压调节以及钙转运等功能受到影响，细胞色素 C 氧化酶活力显著降低。休克缺血低氧所致酸中毒也可促进线粒体膜通透性增高及离子转运功能紊乱，从而也影响了线粒体正常膜电位的维持4。本实验主要研究 Rg1 对失血性休克时大鼠肠上皮细胞线粒体 COX 活性及膜电位的影响。61 Rg1 对失血性休克肠上皮细
16、胞线粒体 COX 活性的影响及其调节机制COX 是由线粒体基因组与核基因组各自编码的亚基共同组成的复合物，是呼吸酶系中的关键酶，其酶活性变化直接影响整个呼吸链的功能变化。同时 COX 又是最不稳定、最易受损的酶，尤其易受自由基氧化损伤，引起电子传递过程中电子漏失，电子传递效率下降。早期的研究发现 COX 活性下降与失血性休克后缺血低氧性细胞损伤有关5，6。本实验观察到，随着休克时间延长，大鼠肠上皮细胞缺血低氧加重， COX 活性会逐渐下降，影响整条呼吸链功能，使三磷酸腺苷（ATP）合成减少。大鼠失血性休克 5 小时肠上皮细胞线粒体 COX 活性显著低于正常对照组，说明缺血低氧可影响线粒体内膜呼吸链的电子传递速率，降低线粒体利用氧的能力。复苏加 Rg1 可显著提高 COX 活性，可使其活性维持在较高水平。Burke 和 Poyton7对低等真核生物酵母的研究认为，缺血低氧可能通过两种途径影响酶活性：（1）长期调节，即缺血低氧可通过影响基因的表达，导致有活性的酶分子数的改变。本实验研
