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1、1 受体阻滞剂普奈洛尔对大鼠脑创伤后 脑组织中 IL1 和 IL1Ra 的影响作者：仇威富 白祥军 唐朝晖【摘要】 目的 探讨 受体阻滞剂（普奈洛尔）对大鼠脑创伤后脑组织中白细胞介素 1（IL 1）和白细胞介素 1 受体拮抗剂（IL 1Ra）的影响。方法 选取 SD 大鼠 72 只，随机分为对照组（36 只）、治疗组（36 只）。采用改良的 Feeney 法致大鼠右顶叶脑创伤模型, 分别给予生理盐水、普奈洛尔腹腔注射(40mg/kg）。每组于致伤后 6、24、72 小时 3 个时相点，取右顶叶损伤区脑组织，苏木精 伊红染色（HE染色）法观察其病理变化，免疫组织化学和免疫印迹（Western b
2、lotting）方法检测其中 IL 1 和 IL 1Ra 的表达。结果 对照组：伤后 6 小时即可见变性坏死神经元，且 IL 1 有大量表达，24 小时达高峰；IL 1Ra 有极少表达并逐渐升高。 治疗组：变性坏死神经元明显减少，IL 1 表达降低；而 IL 1Ra 6 小时即有明显表达并持续至 72 小时；且 IL 1/IL 1Ra 比值较对照组降低。两组比较，差异具有统计学意义(P0.05)。结论 受体阻滞剂能明显降低大鼠脑损伤区 IL 1 表达、提高IL 1Ra 表达，可能对减轻大鼠脑创伤后炎性损伤具有一定作用。 【关键词】 普奈洛尔 颅脑损伤 大鼠 白细胞介素 1 白细胞介素 1Ra研
3、究表明，白细胞介素 1（IL 1）作为一种促炎性细胞因子参与脑创伤后炎性反应1。Woiciechowsky 等2研究证实 受体阻滞剂可阻断 IL 1 引发的中枢神经系统炎性反应。白细胞介素 1 受体拮抗剂（IL 1Ra）是脑组织中天然存在的、能降低 IL 1 炎性损伤的拮抗剂。基于此，本研究旨在探讨 受体阻滞剂(普奈洛2尔)对大鼠脑创伤后脑组织中 IL 1 和 IL 1Ra 表达的影响及其机制。材料与方法1 实验材料健康雄性 SD 大鼠 72 只，体重(25020)g（购自同济医学院实验动物中心）。受体阻滞剂选取普奈洛尔（湖北华中药业有限公司,武汉），IL 1 单克隆抗体（博士德公司，武汉），
4、IL 1Ra 单克隆抗体（Santa Cruz 公司，美国）。大鼠脑立体定位仪、手术器械等。2 动物分组与模型制作大鼠随机分为对照组(36 只)和治疗组(36 只)，每组分别观察创伤后 6、24、72小时 3 个时相点，各时相点大鼠 12 只，随机选取 6 只分别进行免疫组织化学和免疫印迹（Western blotting）实验。按改良的 Feeney 法（击锤重 40g，底面直径约4mm，15cm 高处自由落体）致大鼠右顶叶脑创伤模型。自伤前 0.5 小时起每日 1次，治疗组给予普奈洛尔（40mg/kg）腹腔注射治疗，对照组给予等量生理盐水3。3 标本采集及实验方法3.1 SP 法 大鼠经麻
5、醉、开胸、左心室插管，4多聚甲醛液灌注 4560 分钟后取出大鼠脑组织块，石蜡包埋切片，进行苏木精 伊红染色（HE 染色）观察病理变化及免疫组化观察损伤区域脑组织中的 IL 1 和 IL 1Ra 表达变化情况。用彩色图像分析系统（HPISA 1000 高清晰度彩色病理图文分析系统）对免疫组化染色的阳性细胞进行定量分析，选平均光密度（ODI）作统计指标。33.2 Western blotting 实验 （1）组织蛋白提取：大鼠麻醉后，立即断头处死，迅速取出损伤区域脑组织，剪碎后用生理盐水洗去表面血液；加入裂解液 A 中,浸泡 5分钟,转移入二倍体积的裂解液 B,电动匀浆 9000 转 3 分钟,
6、浸泡 3060 分钟。超声振荡 3 分钟,低温离心 12000r/min,20 分钟，取上清液-80保存,待用。 （2）十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）及转膜：取上清于 10SDS PAGE后，将蛋白通过湿式电转移到硝酸纤维素(NC)膜上。 （3）加一抗封闭液稀释，IL 1 浓度 1:400，IL 1Ra 浓度 1:300， 肌动蛋白（ actin）浓度 1:800，4孵育过夜；然后将硝酸纤维素膜置于辣根过氧化物酶（HRP）标记的相应二抗溶液中室温 1 小时，显色曝光。胶片条带经扫描、编辑和打印。用分析软件 Bandscan4.3，对每个目的条带进行总灰度分析， acti
7、n 为内参照，以 IL 1、IL 1Ra 与 actin的积分光密度比值代表其相对表达水平。4 统计学处理数据以s 表示，统计分析采用 SPSS13.0 统计软件进行组间 t 检验。P0.05为差异有显著性意义。结果1 病理形态学观察光镜下观察，对照组 6 小时显示损伤灶蛛网膜下腔出血，神经元变性坏死，胶质细胞呈空泡样变性，血管内有明显白细胞聚集和附壁现象，脑细胞水肿明显；24小时后坏死神经元增多，多发散在血管周围出血。治疗组脑细胞水肿明显减轻，变4性坏死神经元减少，白细胞聚集减少，血管周围出血减少。2 免疫组化结果2.1 IL 1 表达情况 对照组：6 小时即有大量阳性细胞，主要见于创伤侧皮
8、质；24 小时达峰值水平，与 6 小时比较，差异有统计学意义(P0.05)。治疗组：6 小时阳性细胞数较多，24 小时后明显减弱，与对照组比较，差异有统计学意义(P0.01)（图 1）。2.2 IL 1Ra 表达情况 对照组：6 小时后有极少数阳性表达；24 小时阳性细胞数增多并维持至 72 小时，主要见于海马损伤区。治疗组：6 小时即可见较强表达，并持续较高表达至 72 小时（图 2）；与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。2.3 IL 1/IL 1Ra 比值，治疗组同对照组各时相点比较有显著差异(P 0.01)（见表 1）。 3 Western blotting 结果IL 1 于创伤
9、后 6 小时即有明显表达，24 小时达高峰；治疗后呈逐渐降低趋势，与对照组比较，差异具有统计学意义(P0.05)。IL 1Ra 在创伤后 6 小时基本检测不到，24 小时和 72 小时有少量表达；治疗后 6 小时即有较高表达，并持续至 72小时，与对照组比较，差异具有统计学意义(P0.05)（图 3）。IL 1/IL 1Ra 比值，各时相点治疗组同对照组比较有显著差异(P0.01)（见表 2）。图 1 创伤后 24 小时。a.IL 1 表达于大量的棕黄染色的多极神经元和胶质细胞；b.治疗组阳性细胞明显减少(SABC 400)（略）图 2 创伤后 72 小时。a.IL 1Ra 主要表达于呈棕黄染
10、色的神经元；b.治疗组阳5性细胞明显增多(SABC 400)（略）图 3 Western blotting 检测损伤区脑组织 IL 1 和 IL 1Ra 蛋白表达（略）表 1 损伤区脑组织 IL 1、IL 1Ra 表达免疫组化 ODI 结果（略）与伤后 6 小时相比：P0.05；与对照组相比：*P0.05表 1 损伤区脑组织 IL 1、IL 1Ra 表达的 Western Bloting 结果（略）与伤后 6 小时相比：P0.05；与对照组相比：*P0.05讨论细胞因子及其受体有众多的生理功能，在严重创伤病理生理变化中起非常重要作用，而颅脑创伤后，脑组织内许多细胞因子表达会发生变化4。脑创伤后
11、交感神经激活，儿茶酚胺分泌增多，通过 肾上腺能通道影响细胞免疫，诱发包括IL 1 在内的一系列炎性细胞因子释放，可能导致全身性免疫抑制2，5。IL 1、IL 1 和 IL 1Ra 同属于 IL 1 家族。研究提示，IL 1 与脑创伤关系密切,无论在临床患者或实验动物,都能发现脑创伤后脑组织、脑脊液中 IL 1 表达水平的增高1。本实验结果印证了上述观点，大鼠脑创伤后 6 小时脑组织IL 1 表达即升高，24 小时达高峰。迄今研究认为，在脑组织内，IL 1 主要来源于星型胶质细胞、小胶质细胞及神经元等6。IL 1 介入中枢神经系统的主要功能有：通过下丘脑 垂体 肾上腺(HPA) 轴,参与神经内分
12、泌活动；调节垂体前叶细胞的生长；刺激胶质细胞的生长及分化；诱导其它细胞因子的产生,如神经生长因子(NGF)；抑制神经元钙离子的流通；增加 氨基丁酸(GABA)受体的活性等65，7。过量的 IL 1 不仅促进神经兴奋毒性细胞坏死,而且通过激活蛋白激酶p38 和 c Jun 氨基末端激酶活性而诱发细胞凋亡8。我们推测，抑制 IL 1 的过量表达或者阻断其与受体的结合，对脑创伤后有保护作用。IL 1Ra 是体内唯一选择性阻断 IL 1 作用的受体拮抗剂,与 IL 1 竞争性结合 IL 1RI，阻止 IL 1 介导的信号转导，是机体重要的内生性抗损伤物质。有研究将 IL 1Ra 分次注入脑创伤大鼠的侧
13、脑室，发现可以明显减轻脑组织的损伤范围和程度。正常脑组织 IL 1Ra mRNA 表达较低，脑组织 IL 1Ra 含量很少，主要来自神经元和胶质细胞。本实验发现，脑创伤后可检测到少许 IL 1Ra，并在检测时间内逐渐增多。比较本实验结果可以看出，创伤后 IL 1Ra 的表达升高明显滞后于 IL 1，这可能是 IL 1 过量表达对机体造成损伤后自发的一种保护作用，但对 IL 1 导致的早期损害，如神经元的变性坏死可能为时已晚。我们认为脑组织内 IL 1/IL 1Ra 比值改变是脑创伤后颅内病理生理改变的一个重要因素。普奈洛尔是一种非选择性 肾上腺素受体阻滞剂，其发挥药理作用的机制，主要是受体阻断
14、作用和细胞膜效应。在临床患者和动物实验中发现很多高浓度的心血管药物会引起多种炎症介质的紊乱，普奈洛尔却没有这种现象9。实验中，我们对大鼠创伤前后给予普奈洛尔干预，光镜下观察脑组织病理形态改变，发现治疗组较对照组脑细胞水肿明显减轻，变性坏死神经元减少，神经胶质细胞增生减弱；创伤后各时相点脑组织 IL 1 表达较对照组明显减少，IL 1Ra 在伤后早期即有明显表达，并持续增多；IL 1 和 IL 1Ra 的表达变化和脑组织病理形态改变密切相关。我们认为，普奈洛尔能够影响大鼠脑创伤后 IL 1 和 IL 1Ra 的表达，对脑创伤后早期有保护作用，其机制可能在于：（1）降低脑创伤后 IL 1 的表达：
15、7抑制脑创伤后交感神经兴奋，减少儿茶酚胺的分泌，阻断 受体介导的 CAMP 蛋白激酶 A 途径，降低创伤应激引起的 IL 1 释放及由 IL 1 诱发的其他致炎性细胞因子的表达，减弱了创伤后早期大量 IL 1 对脑损伤的瀑布效应；（2）减少创伤后高分解代谢，降低能量需求10；（3）缓解脑创伤后中枢性高血压；（4）提高了脑创伤后脑组织中 IL 1Ra 的表达，对抗 IL 1 的损伤作用，对于其影响IL 1Ra 表达的机制尚不清楚，有待进一步研究。【参考文献】1Zhu T,Yang SY,Yuan HN.Changes of interleukin beta,tumor necrosis fact
16、or alpha and interleukin 6 in brain and plasma after brain injury in ratsJ.Chin J Traumatol，2004，7(1):32-35.2Woiciechowsky C,Volk HD.Increased intracranial pressure induces a rapid systemic interleukin-10 release through activation of the sympathetic nervous systemJ.Acta Neurochir Suppl,2005,95（9）:373-376.3Johnson JD,Campisi J,Sharkey CM,et al.Catecholamines mediate stres
