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1、1Wnt 信号传导通路在塞来昔布抗结肠癌 生长中的作用作者：赵士彭 蔡建辉 赵发 徐德龙 卞红磊 张燕 桂林【摘要】 目的 研究 Wnt 信号传导通路在塞来昔布抗结肠癌生长中的作用。方法 将人结肠癌 HT 29 细胞注射于裸鼠背部皮下建立移植瘤模型，16 d 后，将裸鼠随机分为对照组、低、中和高剂量塞来昔布组（25、50 和 100 mgkg-1d-1），对照组灌胃给予灭菌蒸馏水，各塞来昔布组给予相应剂量的塞来昔布。给药 35 d 后，以免疫组织化学方法检测瘤组织 COX 2 蛋白表达，以 TUNEL 方法检测细胞凋亡，以 Western 印迹方法检测凋亡抑制蛋白生存素（survivin）和
2、连接素（ catenin）蛋白的表达。结果 低、中和高剂量塞来昔布组的抑瘤率分别为 34.94%、39.20%和 59.20%，与对照组比较，塞来昔布各组移植瘤体积明显缩小(P0.05)，各组COX 2、survivin 和 catenin 蛋白表达水平均明显降低（均 P0.05）。塞来昔布对肿瘤生长、细胞凋亡、COX 2 和 survivin 表达的影响程度随用药剂量的增加而增强。结论 不同剂量的塞来昔布均能明显抑制结肠癌移植瘤的生长，其抑制作用呈明显的剂量依赖性，这种作用是通过 COX 2 依赖或非依赖途径对 Wnt 信号通路的抑制来诱导细胞凋亡实现的。低剂量塞来昔布是临床治疗的较好选择。
3、 【关键词】 结肠癌；环氧化酶 2 抑制剂；survivin； 连接素；细胞凋亡【Abstract】 Objective To study the effect of Wnt signal pathway on celecoxib against colon cancer.Methods Human colon cancer HT 29 cells were injected into the BALB/c nude mice back subcutaneously to establish transplantable tumor model.After 16 days，mice were
4、randomly divided into control group and，low，middle and high dose celecoxib groups (25,50 and 100 mgkg-1d-1).Mice were given sterilized 2distilled water and different doses of celecoxib in control and different celecoxib groups respectively.The expression of COX 2 protein was measured by immunohistoc
5、hemistry method，apoptotic cell was detected by TUNEL，and apoptosis inhibition protein survivin and catenin protein were examined by Western blot in carcinomic tissue.Results The inhibition rate of low，middle and high dose of celecoxib was 34.94%，39.20% and 59.20% respectively.Compared with control g
6、roup，the volumes of transplantable tumor of three dose of celecoxib groups were all small(all P0.05),and the expressions of COX 2，survivin,and catenin were low (all P0.05).The effect of celecoxib on tumor growth，cell apoptosis，and the expressions of COX 2 and survivin turned large with the increasin
7、g of dose.Conclusions Celecoxib can suppress tumour growth in different dose and the inhibition effect has obvious dose dependence，which come true by inhibiting Wnt signal pathway dependent or independent on COX 2 and inducing cell apoptosis.Low doses of celecoxib is a better choice for the clinical
8、 treatment.【Key words】 Colon cancer；COX 2 inhibitor；Survivin； catenin；Cell apoptosis非甾体抗炎药(NSAIDs)和昔布类选择性环氧化酶 2(COX 2)抑制剂可抑制COX 2 的活性，使人类患结肠癌的危险性下降 40%50%1。目前对 COX 2 抑制剂抗结肠癌生长的作用机制未完全明确。Wnt 信号传导通路中的多个成员在结肠癌癌变过程中出现异常改变2，研究认为 COX 2 抑制剂舒林酸可通过抑制Wnt 通路诱导肝癌细胞凋亡3，并可抑制结肠癌细胞抗凋亡蛋白生存素(survivin)的表达。COX 2 在瘤组织中的
9、表达与 Wnt 信号传导通路中的关键因子 连接素( catenin)存在相关性。但 COX 2 抑制剂在体内如何影响 Wnt 信号传导通路中的信号传递未见报道。本实验通过建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，以不同剂量选择性 COX 2 抑制剂塞来昔布对裸鼠结肠癌模型分组进行干预治疗,研究塞来昔布对人结肠癌裸鼠移植瘤生长、细胞凋亡及 Wnt 信号通路中凋亡抑制蛋白survivin 和 catenin 表达的影响。1 材料与方法1.1 细胞培养及裸鼠皮下移植瘤模型的建立31.1.1 实验动物 45 周龄 BALB/c 雌性裸小鼠 40 只，体重 2024 g（中国医学科学院北京动物研究所），实验动物合
10、格证编号：SCXK 2005 0013。于无特定病原体环境饲养。1.1.2 细胞培养 小牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶和一次性培养瓶（美国Hyclon 公司）；人结肠癌细胞株 HT 29 和 D/F12 培养基（中国协和医科大学基础医学院基础医学细胞中心）。使用含 10%新生牛血清、 100 U/ml 青霉素和 100 U/ml 链霉素的 D/F12 培养基，培养 HT 29 细胞于 37含 5%CO2 培养箱中，适时消化传代。1.1.3 模型建立及分组干预治疗 处于对数生长期的 HT 29 细胞，以 0.25%的胰酶、0.02%EDTA 液进行消化，以血细胞计数板进行计数后用不含血清的
11、D/F12 培养基稀释，细胞密度为 1.25107/ml，每只裸鼠皮肤消毒后以 1 ml 注射器分别于颈背部皮下注射 0.2 m1 细胞悬液，接种细胞 2106/只。定期观察小鼠精神、饮食及排便等情况，游标卡尺测量肿瘤结节的长径(a)、短径(b)，按公式 V=ab2/2，估算肿瘤近似体积。待移植瘤平均直径约 5 mm 后(细胞种植后第 16 天)，将裸鼠随机分为对照组、塞来昔布低、中和高剂量组（25、50 和 100 mgkg-1d-1），每组 10 只。塞来昔布（辉瑞制药有限公司）采用灌胃给药，对照组灌胃给予灭菌蒸馏水。给药35 d 后，测量肿瘤体积，计算抑瘤率，处死动物留取肿瘤组织，部分置
12、于 4%多聚甲醛溶液中固定，常规包埋切片。部分置于液氮中冻存备用。1.2 免疫组化检测 COX 2 表达 采用 SP 法，石蜡切片常规脱蜡至水，抗原热修复，分别滴加一抗和二抗，DAB 显色，苏木精复染。光学显微镜下观察并拍照。4COX 2 阳性产物为棕黄色颗粒，位于细胞胞质中，细胞胞浆及胞核周围呈黄色者判为阳性。先在低倍镜下对组织切片全面观察，随后于 200 倍光镜下，随机观察10 个高倍视野，以北航真彩色病理图像分析系统计算平均积分光密度值。 1.3 Western 印迹法检测结肠组织 survivin 和 catenin 蛋白 取待测组织 100 mg，加入组织裂解液 1 ml，匀浆。取上
13、清液测定蛋白浓度。取 80 g 蛋白加入缓冲液，煮沸变性 5 min，迅速低温冷却后行琼脂糖凝胶电泳。将靶蛋白从凝胶转移至 PVDF膜，PVDF 膜冲洗后加入配好的封闭液，4过夜。封闭好的 PVDF 膜加入一抗（1200），4过夜。洗涤过的 PVDF 膜加入二抗应用液（12 000），室温避光缓慢摇动 60 min。取出 PVDF 膜洗 3 次，DAB 显色。照像并观察结果。1.4 TUNEL 染色检测移植瘤细胞凋亡指数 TUNEL 染色，按试剂盒(Promega Biotech Co.，Ltd)说明进行，二氨基联苯胺显色后封片。镜下观察染色切片，以细胞核染成棕黑色者为凋亡细胞,在 400 倍
14、视野下随机选取 5 个癌细胞区，计数细胞总数和凋亡细胞数，计算 TUNEL 染色阳性细胞的百分率，即为凋亡指数(AI):AI=凋亡细胞数/癌细胞总数100%。1.5 统计学处理 所有数据以 xs 表示，应用 SAS6.12 统计学软件进行 ANOVA方差分析。2 结 果2.1 成瘤及裸鼠一般情况 40 只裸鼠均成瘤，成瘤率 100%，成瘤时间为细胞种植后第 511 天。肿瘤细胞种植后第 16 天，肿瘤直径平均达 5 mm。成瘤后早期裸鼠的体重，活动情况没有明显改变，随着肿瘤形成并逐渐增大，裸鼠逐渐出现消瘦，活动减少。在实验后期，塞来昔布高剂量组裸鼠活动明显减少，精神状态差，2 只5裸鼠死亡。实
15、验结束切取瘤组织后，对裸鼠解剖，各组均未发现移植瘤肝转移。2.2 塞来昔布对移植瘤生长的影响 给药前各组裸鼠移植瘤体积之间无显著差异（P0.05）；低、中和高剂量塞来昔布均能明显抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长，其抑瘤率分别为 34.94%，39.20%和 59.20%，均较对照组移植瘤生长缓慢（均P0.05），且高剂量组较低剂量组的移植瘤生长缓慢（P0.05），其余各组间抑瘤率无明显差异，见表 1。表 1 各组裸鼠移植瘤体积比较2.3 塞来昔布对移植瘤 COX 2 表达的影响 与对照组比较，塞来昔布各组COX 2 表达水平均明显降低（均 P0.05）；高剂量塞来昔布组表达水平较低剂量组明显降低（
16、P0.05），而中剂量组与低、高剂量组间无显著差异 (P0.05)，见表 2。2.4 塞来昔布对移植瘤 survivin 和 catenin 蛋白表达的影响 与对照组相比，塞来昔布各组 survivin 蛋白表达水平均明显降低（均 P0.05），其中高剂量塞来昔布较低剂量组表达更低（P0.05），而中剂量组与高、低剂量组间无显著差异（均P0.05）。塞来昔布各组 catenin 蛋白表达均低于对照组（均 P0.05），而塞来昔布各组间的蛋白表达均无差异（P0.05），见表 2、图 1。2.5 塞来昔布对移植瘤细胞凋亡的影响 与对照组比较，塞来昔布各组肿瘤组织细胞凋亡明显增加（均 P0.05）。高剂量塞来昔布组移植瘤细胞凋亡较低、中剂量塞来昔布组明显增高（均 P0.05），见表 2，图 2。表 2 各组裸鼠移植瘤COX 2、survivin、 catenin 的表达和细胞凋亡比较 图 2 TUNEL 染色检测各组移植瘤细胞凋亡
