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1、1IL18 对 HK2 细胞 E钙黏蛋白表达 的作用及其可能的胞内信号途径作者：陈伟, 梁东, 姚翠微, 陶静莉, 陈孝文, 刘华锋【摘要】 目的: 探讨白细胞介素18（IL18）是否通过核因子B（NFB）细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化。方法: 实验分单纯 IL18 刺激组和 SN50 预孵育组, 单纯 IL18 刺激组采用终浓度分别为 0、 1、 10、 100 g/L的 IL18 处理人肾小管上皮细胞株（HK2 细胞）72 h, SN50 预孵育组在此基础上预先应用终浓度为 100 mg/L 的 NFB 特异性抑制剂 SN50 预处理细胞 0.5 h。然后应用免疫细胞化学法
2、检测 HK2 细胞 Ecadherin 的表达百分数; 采用RTPCR 法检测 HK2 细胞 Ecadherin mRNA 的表达。结果: NFB 特异性抑制剂 SN50 可拮抗 IL18 对 HK2 细胞 Ecadherin mRNA 和蛋白表达的抑制作用。结论: IL18 可通过核因子B（NFB）细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化。 【关键词】 上皮细胞间充质细胞转分化; IL18; NFB; 肾小管上皮细胞Abstract AIM: To explore the effect of NFB signaling pathway in interleukin18induced t
3、ransdifferentiation in renal proximal tubular cells. METHODS: In IL18 stimulation groups, HK2 cells were challenged with different concentrations (0, 1, 10, 100 g/L) of IL18 for 72 h; In SN50 preincubation groups, HK2 cells were incubated with 100 mg/L SN50 for 30 min before IL18 was added. At the e
4、nd of the incubation, the expression of Ecadherin was determined by the combination of immunocytochemistry and RTPCR. RESULTS: Percentage of Ecadherin positive expression HK2 cells was decreased by IL18 in dosage dependant manner. Expression of Ecadherin mRNA in HK2 cells was also decreased by IL18
5、in dosage dependant manner. Recovered the mostly part of expression of Ecadherin was found after HK2 cells were pretreated with SN50. CONCLUSION: IL18induced transdifferentiation of RTECs is suppressed by 2blocking NFB signaling pathway. IL18induced transdifferentiation of RTECs at least is partly v
6、ia NFB pathway.Keywordsrenal tubular epithelial cells; interleukin(IL)18; nuclear factorB; epithelialmesenchymal transdifferentiation近年来已证实肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells, RTECs）间充质细胞转分化（epithelialmesenchymal transdifferentiation, EMT）在肾间质纤维化过程中发挥重要作用1, 2。稳定上皮细胞的物质主要是上皮细胞表型稳定物质如钙黏蛋白（Ecadherin
7、）表达丧失和/或间充质细胞标志蛋白如 平滑肌肌动蛋白的表达是 EMT 的重要标志3, 4。 IL18 是一多功能炎症因子, 我们前期研究发现: IL18 可促进近曲小管上皮细胞转分化5, 但其细胞内通路尚不明确。有研究证实许多免疫炎症因子, 包括肿瘤坏死因子、 白细胞介素、 黏附分子、 单核细胞趋化因子1 等均含有核因子B（NFB）的结合位点6; 另外有人研究发现阻断 NFB 途径可以抑制 EMT7。因此, 本研究通过观察 NFB 特异性抑制剂SN50（可透过细胞膜, 抑制 NFB 复合体核转位）对 IL18 所诱导 HK2 细胞Ecadherin 表达的变化, 旨在进一步探讨 IL18 促进
8、 RTECs 转分化的细胞内通路。1 材料和方法1.1 材料 人近端肾小管上皮细胞株（HK2）由上海第二医科大学瑞金医院肾科陈楠教授惠赠, IL18 购自日本 MBL 公司, DMEM/F12 培养基、 FCS 购自美国Gibco 公司, 多克隆鼠抗人 Ecadherin 一抗购自武汉博士德, 二抗试剂盒及 DAB染色试剂盒均购自北京中杉公司, TRIzol、 ThermoScriptTM RTPCR System 均购自美国 Invitrogen 公司。1.2 方法31.2.1 细胞培养与鉴定 冻存的 HK2 细胞从液氮复苏后培养于含 100 mL/L FCS、 1108 U/L 青霉素及
9、100 mg/L 链霉素的 DMEM/F12 培养液中并进行传代培养, 培养条件为 37、 50 mL/L CO2、 100%湿度。经相差显微镜、 扫描电镜以及免疫细胞化学（Cytokeratin18 蛋白染色）鉴定证实为 RTECs 后用于实验。实验开始时将 HK2 细胞以 1109/L 密度接种于内置盖玻片的 6 孔板中, 每孔 1.5 mL, 用含 100 mL/L FCS 的 DMEM/F12 培养液培养 24 h 后, 换用无血清培养液同步 24 h 后用于实验。全部实验重复 3 次。1.2.2 实验分组 （1）单纯 IL18 刺激组: 只加入 IL18, 使终浓度分别为 0、 1、
10、 10、 100 g/L, 继续培养 72 h 后按期收集细胞; （2）SN50 预孵育组: 在加入IL18 之前预先加入终浓度为 100 mg/L 的 SN50 预孵育 30 min, 其余实验过程同单纯 IL18 刺激组。1.2.3 免疫细胞化学法检测 HK2 细胞 Ecadherin 的表达 采用免疫细胞化学二步法。按期收集细胞爬片, PBS 冲洗 3 次后 40 g/L 多聚甲醛溶液固定细胞; 30 mL/L H2O2 处理以阻断内源性过氧化酶活性; 抗原微波修复; 滴加一抗（1100 多克隆鼠抗人 Ecadherin 抗体, ）, 4过夜; 次日 PBS 冲洗 3 次后滴加 1250
11、 通用型 lgG 抗体HRP 多聚体; PBS 冲洗 3 次后滴加 DAB 显色剂, 最后苏木素复染。每次实验均用 PBS 代替一抗作空白对照。结果观察: 显微镜下观察细胞形态并计数随机视野 1 000 个细胞中 Ecadherin 阳性细胞百分数, 以胞膜及部分胞质染成棕黄色的细胞为阳性细胞, 计算阳性细胞百分率。1.2.4 RTPCR 法检测 HK2 细胞 Ecadherin mRNA 的含量 用 TRIzol 一步法4抽提细胞总 RNA。继之应用 ThermoScriptTM RTPCR System 进行 cDNA 第 1链合成。PCR 引物序列、 扩增条件及产物长度见表 1, PCR
12、 扩增系统包括10PCR 缓冲液 2 L, 25 mmol/L MgCl2 1.2L, 10 mmol/L dNTP mix 0.4 L, 5 mmol/L 正链及反链引物各 0.8 L, Taq 酶 2 U, cDNA 1 g, 最后加 H2O 至总体积20 L。各取 5 L PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳, 应用 UVP 凝胶成像系统进行结果分析, 以目的基因（Ecadherin）扩增带积分吸光度与内参基因（GAPDH）扩增带积分吸光度之比值表示 Ecadherin mRNA 的相对表达量。表 1 PCR 特异性引物及扩增条件1.2.5 统计学分析 实验结果用 xs 表示, 数据处理采用 S
13、PSS13.0 统计软件进行统计分析, 组内比较采用单因素方差分析; 组间比较采用配对 t 检验。 2 结果2.1 SN50 可拮抗 IL18 诱导的 HK2 细胞 Ecadherin 表达下调 免疫组化结果显示, 正常对照组 HK2 细胞呈多边形铺路石状, 且胞膜及胞质内强烈表达Ecadherin, 单纯 IL18 组 HK2 细胞多呈梭形、 长条状, Ecadherin 的表达随 IL18 刺激浓度的增大而减少, 经 SN50 预处理的 HK2 细胞形态由梭形恢复为多边形铺路石状, Ecadherin 表达较单纯 IL18 组有所上升（表 2）。表 2 SN50对 IL18 诱导 HK2
14、细胞 Ecadherin 表达的影响2.2 SN50 可拮抗 IL18 诱导的 HK2 细胞 Ecadherin mRNA 表达下调 RTPCR 结果显示, 单纯 IL18 组 HK2 细胞 Ecadherin mRNA 的表达随着IL18 浓度的增加相应减少, SN50 预孵育组 HK2 细胞 Ecadherin mRNA 的表达较单纯 IL18 组增加（表 3, 图 1）。表 3 SN50 对 IL18 诱导的 HK2 细胞Ecadherin mRNA 表达的影响53 讨论IL18 是一促炎细胞因子, 我们与国内外同行学者的研究均已经证实 IL18 可促进多种各种急、 慢性肾损伤过程5,
15、8。RTECs 表型转化是肾间质纤维化重要的病理生理基础之一。近年来, RTECs 转分化的细胞内信号转导机制也已备受关注。NFB 是由 P65 和 P50 蛋白亚基组成的二聚体, 其主要生物功能之一就是通过调控一系列重要基因的表达参与免疫和炎症反应, 已有证据显示 NFB 在EMT 中起重要介导作用, IL18 是否通过 NFB 途径促进 RTECs EMT 尚未见文献报道。本研究结果显示, IL18 呈剂量依赖性抑制 HK2 细胞 Ecadherin 基因及蛋白的表达, 而 NFB 特异性抑制剂可显著逆转此作用, 且 SN50 作用后 HK2 细胞形态由梭形长条状恢复为多边形铺路石状, 表明 IL18 可能是通过 NFB 途径抑制 Ecadherin 表达的, 而该途径被阻断则显示出一定程度上 EMT 的逆转。我们曾报道 NFB 选择性抑制剂 PDTC 对单侧肾梗阻模型肾纤维化具有一定的治疗作用9, 而此研究从体外角度进一步证实阻断 NFB 通路对肾纤维化具有治疗价值。下一步的研究是寻找一种无生物毒性且对某些人类肾纤维化有确切治疗作用的 NFB 选择性抑制剂。【参考文献】1 Nangaku M. Chronic hypoxia and tubulointerstitial injury: A final common pathway to ends
