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1、1Wnt3 基因在急性髓系白血病中的表达及 意义作者：李胜利，徐开林，李振宇，潘秀英，曾令宇【摘要】 目的 研究 Wnt3 基因在急性髓系白血病（AML）患者中的表达及其意义。方法 应用实时定量 PCR（real-time PCR）方法检测 10 名正常人、40 例 AML 患者中 Wnt3 基因的表达。结果 10 例正常人中检测到较低水平 Wnt3 基因的表达；Wnt3 基因在 AML 患者中的表达水平增高，AML 缓解后 Wnt3 基因的表达水平较初诊时明显降低；Wnt3 的表达与 AML 患者年龄、性别以及初诊白细胞数等临床特征无关；Wnt3 低表达组完全缓解率高于高表达组。结论 Wnt
2、3 在 AML 发病中可能起重要作用，可作为判断 AML 预后的一个指标。 【关键词】 急性髓系白血病；Wnt3 基因；基因表达Abstract： Objective To explore the expression and significance of Wnt3 gene in acute myelogenous leukemia (AML) patients. Methods Expression of Wnt3 gene was detected by real-time PCR in 10 healthy people and 30 AML patients. Results Th
3、e expression of Wnt3 gene was lower in the 10 healthy people and was higher in AML patients. There was marked decline in the expression level of Wnt3 gene after complete remission as compared to the initial treatment. The expression level of Wnt3 gene was not correlated with the age, gender and the
4、clinical characteristics at initial diagnosis such as the white blood cell (WBC) count and chromosomal karyotype in AML patients. The complete remission (CR) rate in AML patients with low expression level of Wnt3 gene was higher than that in those with high expression level. Conclusion Wnt3 may play
5、 an important role in AML pathogenesis and can serve as an index in monitoring AML prognosis.Key words: acute myeloid leukemia; Wnt3 geme; gene expressionWnt3 基因首次发现于小鼠的乳腺癌细胞，将小鼠乳腺癌病毒插入 Wnt3 基因位点附近可以诱导乳腺癌的发生。人类的 Wnt3 基因定位于 17 号染色体长臂2（17q21）1，在急性髓系白血病（AML）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者以及乳腺癌卵巢癌细胞株中表达增加。本实验采用实时定量 P
6、CR（real-time PCR）方法检测 Wnt3 基因在 40 例 AML 患者中的表达，并分析其意义。1 资料和方法1.1 研究对象1.1.1 实验组 2007 年 6 月2008 年 6 月徐州医学院附属医院血液科住院和门诊 AML 患者 40 例（初诊 30 例，复发 10 例）。其中 M2 15 例，M3 6 例，M4 8 例，M5 11 例。男 20 例，女 20 例，中位年龄 36（1176）岁。10 例初诊 AML 患者随访其缓解前后骨髓，随访中位时间 1(0.53)个月。所有患者经过骨髓细胞形态学、组织化学染色、免疫表型、分子生物学、细胞遗传学等检查确诊。完全缓解（CR）指
7、临床、血象及骨髓细胞学缓解，未缓解指部分缓解（PR）和未缓解(NR)。1.1.2 正常对照组 10 名，男 4 名，女 6 名，中位年龄 32（2448）岁，均为缺铁性贫血患者和造血干细胞移植供者。1.2 主要试剂、仪器 Trizol 抽提试剂盒（BBI 公司）、AMV 逆转录酶试剂盒（TOYOBA 公司）、Taq DNA 聚合酶试剂盒（纽英伦生物技术有限公司）、dNTPs(SANGON 公司)、DAN Ladder(MBI 公司)、SYBR Premic Ex Taq 试剂盒（TOYOBA 公司）、DEPC（AMRESCO 公司）、PE-2400 PCR 基因扩增仪（ABI 公司）、Real
8、-time 7500 荧光定量 PCR 仪（ABI 公司）。Wnt3 引物序列（扩增产物 147 bp,退火温度 59）：上游 5-3ACGCTGACTTCGGCGTGTTAG-3；下游 5-CGTGGCACTTGCATTTGAGG-3。内对照 2,3-二羟基丙醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物序列（扩增产物 203 bp,退火温度 57）：上游 5-TGTTGCCATCAATGACCCC-3；下游 5- ACTCCACGACGTACTCAGCG-3。1.3 方法1.3.1 骨髓单个核细胞（MNC）的分离 无菌条件下抽取骨髓 2 ml，肝素抗凝，用等体积的 Ficoll 淋巴细胞分离液，分离
9、出 MNC，用 1PBS 洗涤 2 次，取 5107 个细胞，-80冻存备用。1.3.2 总 RNA 的提取 细胞总 RNA 由 Trizol 抽提试剂盒提取，按 Trizol 抽提试剂盒说明书进行，所提总 RNA 经分光光度计测定光密度（D），D260/D280 值在1.82.0 者用于 real-time PCR 检测。1.3.3 cDNA 第一链的合成 20 l 反应体系包括：5RT Buffer 4 l,2.5 mmol/L dNDP 2 l,Oligo(dT)18 1 l,RNA Simple 3 l,AMV 逆转录酶 2 l，补无核酶水至20 l。反应条件为 30 10 min,4
10、2 60 min,99 5 min 灭活逆转录酶。cDNA 于-20保存。1.3.4 制备用于绘制标准曲线的梯度稀释 DNA 模板 选择表达 Wnt3 基因的cDNA 模板进行 PCR 反应，25 l 反应体系包括：2.5 mmol/L dNTP 2.5 l,10PCR缓冲液 2.5 l,Taq DNA 聚合酶 1 U,上下游引物各 1 l,cDNA 1 l,加水至总体积 25 l。采用的循环参数为:95预变性 5 min,35 个 PCR 循环（94，30 s；退火温度，20 s；72，30 s）, 72延伸 5 min。PCR 产物在 2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 PCR 产物为
11、单一特异性扩增条带；同样的方法获得 GAPDH 的扩增条带（图1）。将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释：设定 PCR 产物浓度为 108，分别稀释为41108、1107、1106、1105 这几个梯度浓度的 DNA。1.3.5 进行 real-time PCR 反应 50 l real-time PCR 反应体系包括:SYBR Premix Ex Taq 25 l,上下游引物各 1 l,cDNA 或 DNA 1 l,补水至总体积为 50 l。GAPDH：95，10 s；40 个 PCR 循环（95，3 s；60，20 s；72，36 s）；溶解曲线（95，15 s；60，1 min；95，
12、15 s）。Wnt3：95，10 s；40 个 PCR 循环（95，3 s；59，20 s；72，36 s）；溶解曲线（同上）。1.3.6 检测指标的计算 各样品的目的基因（Wnt3）和管家基因（GAPDH）分别进行 real-time PCR 反应。根据绘制的浓度梯度稀释 DNA 标准曲线，对各样品的目的基因和管家基因进行定量。每个样品的 Wnt3 浓度除以 GAPDH 的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。1.4 统计学处理 用 SPSS 13.0 统计分析软件分析实验数据，rea-time PCR 实验结果半定量比值以s 表示、阳性率以百分比（%）表示，两均数进行 t 检验, 多组
13、均数进行单因素方差分析,两配对均数进行配对 t 检验，率的比较进行 2 检验，P0.05 为差异有显著性。 2 结 果2.1 Wnt3 在 AML 患者中的表达 10 例正常人检测到较低水平 Wnt3 基因的表达。初诊、复发组的 Wnt3 表达均比正常对照组升高，差异有显著性（P0.05）。复发组和初诊组相比较，Wnt3 基因的表达水平差异无显著性（P 0.05）。见表 1。表 1 3 组 Wnt3 基因的表达正常对照组比较：P0.052.2 Wnt3 基因表达与 AML 临床特征的关系 AML 患者不同年龄、性别以及初诊白细胞数间 Wnt3 的表达差异均无显著性（P 0.05）。见表 2。5
14、2.3 Wnt3 基因表达与 AML 临床疗效的关系 30 例初诊 AML 患者经 12 个疗程诱导缓解治疗完全缓解率为 70%。根据正常对照组 Wnt3 表达水平 95%可信区间上限(0.1142),将初诊组分为 Wnt3 高、低表达组, 高表达组 23 例中 14 例获完全缓解,完全缓解率为 60.9%,低表达组中 7 例均获完全缓解，完全缓解率 7/7,低表达组的完全缓解率高于高表达组(P=0.048)。表 2 Wnt3 基因表达与 AML 临床特征的关系2.4 10 例初诊 AML 患者缓解前后 Wnt3 基因的表达 随访 10 例初诊 AML 患者，其 Wnt3 基因平均表达水平由初
15、诊时的（0.59980.1290）降低到缓解后的（0.08750.0377），两者的差异有显著性（配对样本 t 检验，P0.05）。3 讨 论Wnt 信号通路的异常是许多肿瘤发生的标志。Wnt 信号通路的破坏复合体组成成分如腺瘤性结肠息肉病基因（APC）和 Axin 基因的突变，能够引起 -catenin 的核内转移和肿瘤的发生2。虽然 Wnt 信号通路的异常在 AML 发生中的作用已经明确3，但是至今未检测到 Wnt 信号通路的破坏复合体成分在 AML 中发生变异，表明其他的机制可能介导了 Wnt 信号通路在 AML 中的异常。最近的研究发现，某些恶性血液病存在 Wnt 自分泌环，即通过上调
16、 Wnt 信号通路上游分子来活化 Wnt/-catenin 信号通路。例如：携带 E2A-PBX1 易位基因前 B 淋巴细胞白血病，可以通过上调 Wnt16 基因的表达而导致疾病的发生4。同样，多发性骨髓瘤高表达 Wnt5a、Wnt10b 和 Wnt16 可引起 -catenin 的活化及核内转移5。由于AML 患者高表达 Wnt 信号通路的上游分子，提示 AML 有可能通过自分泌环的方式异常激活 Wnt 信号通路。6已有报道 Wnt3 在 AML 患者中高表达6，然而该研究样本量偏小，仅 16 例，且平均年龄只有 11 岁。为了进一步明确 Wnt3 基因在 AML 中的表达，我们使用real-time PCR 方法检测 Wnt3 基因在 30 例初诊 AML 患者中的表达。研究发现Wnt3 基因在初诊 AML 患者中表达水平明显增加，这与以往的研究相一致6。提示 AML 可能通过自分泌
