《TRAIL联合PDTC对SGC-7901细胞生长抑制和凋亡诱导的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TRAIL联合PDTC对SGC-7901细胞生长抑制和凋亡诱导的实验研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1TRAIL 联合 PDTC 对 SGC-7901 细胞生长 抑制和凋亡诱导的实验研究【摘要】 目的 观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及 TRAIL 联合核转录因子核因子-B（NF-B）活性特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对胃癌细胞 SGC-7901 的生长抑制和凋亡诱导作用，并寻找逆转 TRAIL 耐药的方法。方法 采用不同浓度的 TRAIL 及 TRAIL 联合 PDTC 作用于胃癌细胞后，MTT 法检测细胞生长抑制率，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，免疫细胞化学染色方法观察药物作用前后 NF-B 表达情况。结果 单独使用 TRAIL 时，随着浓度从 50 g/L增
2、加到 500 g/L，细胞的生长抑制率和凋亡率逐渐增加（P0.05）,但这种作用是非线性的。TRAIL 联合 0.05 mol/L、0.1 mol/L PDTC 后肿瘤细胞的生长抑制率和凋亡率较单用 TRAIL 显著下降（P0.05）；而联合 1 mol/L、10 mol/L PDTC后其作用较上有所上升（P0.05）。联合作用组 p65 蛋白在胞核中染色的强度低于单纯使用 TRAIL 组（P0.05）。结论 TRAIL 对胃癌细胞株 SGC-7901 具有一定程度的生长抑制和凋亡诱导作用；NF-B 信号转导途径可能具有双向调节作用，大剂量 PDTC 可能逆转胃癌细胞对 TRAIL 的耐药。
3、【关键词】 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；吡咯烷二硫代氨基甲酸盐；胃癌细胞；凋亡；核因子-BAbstract：Objective To observe the effect of a combination of pyrrolidine dithiocarbonate (PDTC), a specific inhibitor of NF-B and tumor necrosis factor (TNF)- related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on the apoptosis of gastric cancer cells and their ef
4、fect on the expression of NF-B, and to search for the approaches to reversing resistance to TRAIL in human stomach cancer cells. Methods Various concentrations of TRAIL and PDTC were added in exponential growth SGC-7901 gastric cancer cells. MTT assays were used to measure the growth inhibitory effe
5、ct of combined use of TRAIL and PDTC or alone. Apoptosis of gastric cancer cell SGC-7901 was analyzed 2with PI staining method and flow cytometry (FCM). The expression of NF-B was observed using immunohistochemical staining method. Results After the SGC-7901 gastric cancer cells were exposed to TRAI
6、L at a dose of 50 g/L to 500 g/L, the growth inhibitory rate and apoptosis rate increased (P 0.05), but there was no linearity for this dose-effect relationship. Following TRAIL treatment in combination with 0.05 mol/L and 0.1 mol/L PDTC, the growth inhibitory rate of and apoptosis rate significantl
7、y decreased compared with treatment with TRAIL or PDTC alone (P0.05), while following TRAIL treatment in combination with PDTC 1 mol/L and 10 mol/L, the growth inhibitory rate and apoptosis rates increased compared with treatment with TRAIL or PDTC alone (P0.05). The two drugs presented synergistic
8、or added effect on SGC-7901 cells. The expression of NF-B decreased subsequent to the treatment of PDTC(P 0.05). Conclusion TRAIL has the effect of growth inhibition and apoptosis induction on SGC-7901 gastric cells to some degree. The NF-B signal pathway might have a bidirectional effect in apoptos
9、is regulation, and large dose of PDTC could reduce the resistance of TRAIL in SGC-7901 gastric cells.Key words: tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; pyrrolidine dithiocarbonate; gastric cancer; apoptosis; nuclear transcript factor-B肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related ap
10、optosis inducing ligand , TRAIL) 是肿瘤坏死因子家族的成员之一 ,又名 Apo2L1 。TRAIL 共有 5 种受体2：死亡受体 DR4、DR5，诱骗受体 DcR1、DcR2，一种调节骨密度的受体（OPG）。核因子-B（NF-B）是一种重要的核转录因子 ,参与炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等多种生理和病理过程。研究表明 ,NF- B 在肿瘤的抗凋亡机制中起关键性作用 ,抑制肿瘤细胞 NF-B 的活性将引起肿瘤细胞凋亡 ,从而抑制肿瘤细胞的生长3。细胞凋亡的抑制与恶性肿瘤的发生发展以及化疗不敏感有密切关系 ,因此研究胃癌细胞对 TRAIL 敏感性与 NF-B 表达的关
11、系 ,对揭示胃癌细胞对 TRAIL 的耐药机制可能有重要作用。为此,本研究观察了 TRAIL及 TRAIL 联合 NF-B 活性特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对胃癌细胞株 SGC-7901 细胞的生长抑制和凋亡诱导,并分析了胃癌细胞对 TRAIL 的不同敏感性与 NF- B 表达的关系，以期寻找逆转其耐药的方法。31 材料和方法1.1 材料SGC-7901 胃癌细胞引自中国人民解放军第九七医院肿瘤实验室,TRAIL 蛋白购自 Peprotech 公司，PDTC 购自 Sigma 公司, MTT 购自 Duchefa 公司,二甲基亚砜（DMSO）购自 Amresco 公司,碘化丙
12、啶(PI) 购自 Sigma 公司,RNA 酶购自Faizyme 公司,鼠抗人 NF-B p65 单克隆抗体购自 Santa Cruz 公司,PV-6002 二步法检测试剂盒和 DAB 显色液购自北京中杉金桥生物有限公司,SEAC 全自动酶免系列分析仪购自北京希亚克技术有限公司,流式细胞仪（FCM）购自美国 BD 公司。1.2 方法1.2.1 MTT 法检测肿瘤细胞的生长抑制率1.2.1.1 TRAIL 对胃癌细胞株 SGC-7901 的细胞毒作用细胞以每孔 200 l (2105 个/ml)接种于 96 孔板，培养 24 h 后，分别加入TRAIL，使其最终浓度达到 0、50、100、200
13、、500 g/L,每组复设 6 孔，同时设立不接种细胞的空白对照组。作用 48 h 后,每孔加入 5 g/L 的 MTT 溶液 20 l,继续培养 4 h,弃上清,每孔加入 150 l DMSO,振荡 10 h 后,酶标仪波长 540 nm 测其光密度(D)。抑制率=1-（D 实验组-D 空白对照组）/（DTRAIL0-D 空白对照组)100%。实验重复 3 次,取其平均值。1.2.1.2 应用 PDTC 后 TRAIL 对胃癌细胞株 SGC-7901 的细胞毒作用根据所加药物的不同实验分为 3 组：空白对照组、PDTC 组、TRAIL+PDTC 组。4PDTC 组：PDTC 按 0、0.05
14、、0.1、1、10、50、100 mol/L 给予。TRAIL+PDTC 组:PDTC 浓度分别取 0、0.05、0.1、1、10、100 mol/L，PDTC 每一浓度均分别与TRAIL 的浓度 0、50、100、200、500 g/L 进行组合，共计 30 组。实验步骤及抑制率计算同上。1.2.2 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。1.2.2.1 应用 TRAIL 后胃癌细胞的凋亡细胞以每孔 2105 个/ml 接种于 24 孔板中，分别加入 0、50、100、200、500 g/L TRAIL，每组设 3 个复孔。按试剂盒说明书操作，用 FCM 检测,记录激发波长 488 nm 处的红色荧光
15、。1.2.2.2 应用 PDTC 后细胞的凋亡根据所加药物的不同实验分为 3 组,依次为空白对照组、PDTC 组、TRAIL+PDTC 组。PDTC 组：PDTC 按 0、0.1、10 mol/L 给予。TRAIL+PDTC 组:PDTC 浓度分别取 0、0.1、10 mol/L，每一浓度均分别与 TRAIL 的浓度0、50、100、200、500 g/L 进行组合。实验步骤同上。1.2.3 免疫细胞化学染色检测 NF-B p65 蛋白在 SGC-7901 胃癌细胞中的表达1.2.3.1 TRAIL 作用后 NF-B p65 蛋白在 SGC-7901 胃癌细胞中的表达 细胞培养后制成细胞密度为
16、 1104/ml 的细胞悬液，每孔 1 ml 接种于 24 孔培养板中，24 h 后换液，分别加入对照液(培养液)、TRAIL(50、100、200、500 g/L)，继续培养 1 h，取出细胞爬片，严格按照 PV-6002 二步法检测试剂盒说明书进行操5作。1.2.3.2 PDTC 作用后 NF-B p65 蛋白在 SGC-7901 胃癌细胞中的表达 对照组、200 g/L TRAIL+PDTC 0.1 mol/L 组、200 g/L TRAIL+ PDTC 10 mol/L 组进行免疫细胞化学染色检测。实验步骤同上。1.3 统计学处理用 SPSS 13.0 软件包进行数据处理，计量资料采用s 表示，多组均数两两比较采用 SNK 检验, P0.05 为差异有统计学意义。 2 结 果2.1 胃癌细胞生长抑制率2.1.1 TRAIL 对胃癌细胞生长的影响TRAIL 可抑制 SGC-7901 胃癌细胞增殖,并随药物浓度增
