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1、1bFGF 对拟血管性痴呆小鼠学习记忆及海 马 5HT 和 DA 的影响作者：曲娴 李春颖 苏畅 李冰【摘要】 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对拟血管性痴呆（VD）小鼠学习记忆的影响及其机制。方法 清醒小鼠反复脑缺血再灌注法建立 VD 动物模型；造模后给予 bFGF 干预治疗；采用跳台法、避暗法及 Morris 水迷宫检测小鼠的学习记忆能力，用荧光分光光度法检测脑组织 5 羟色胺(5 HT)和多巴胺(DA)含量，HE 染色观察病理形态学变化。结果 bFGF 组小鼠学习记忆能力提高(P0.01)；海马 5 HT 和 DA 含量增加(P0.05，P0.01)。结论 bFGF 通过调节
2、脑神经递质5 HT 和 DA 含量改善拟 VD 小鼠学习记忆能力。 【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子；血管性痴呆；学习记忆；5 羟色胺；多巴胺有研究认为 65 岁以上的脑卒中幸存者中，大约 13 于发病后 3 个月内出现血管性痴呆（VD）1。在我国，VD 可能是老年期痴呆中最常见的形式2。但其发病的确切病理机制尚不明了，临床干预手段缺乏特异性3。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是神经营养因子的一种，对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持具有不可替代的调节作用4。大量的研究已肯定其对神经保护的作用5，6。而 bFGF 对
3、VD 引起的单胺类递质改变的研究未见报道。为此，本实验在制备 VD 模型小鼠的基础上采用 bFGF 进行干预治疗，并检测 VD 小鼠学习记忆能力、海马 5 羟色胺(5 HT)和多巴胺(DA)含量，旨在探讨 bFGF 治疗 VD 的可能机制，为临床治疗提供理论依据。21 材料与方法1.1 动物与试剂昆明种小鼠，体重（30.03.12）g，雌雄兼用，由长春高新区医学实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK （吉）2007 2008。bFGF 注射液由 Peprotech 提供。DA、5 HT 均由 Sigma 公司提供。1.2 动物模型制备及治疗方法将动物随机分为正常组、假手术组、VD 模型组（简
4、称“模型组”），bFGF 干预组（简称“bFGF 组”）。参照文献采用清醒小鼠反复脑缺血再灌注法建立 VD 动物模型7。清醒小鼠仰位固定，行颈部切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。模型组和bFGF 组固定拉紧丝线阻断血流，10 min 后松线使血液再灌注 20 min，如此反复3 次。假手术组只分离双侧颈总动脉，套丝线扣，但不阻断血流。术后每日肌注青霉素 0.2 万 U，连续 3 d。bFGF 组给予 bFGF 100 g/kg 溶于生理盐水腹腔注射，于手术后首次即刻给药，以后每日 1 次，连用 7 d8。正常组、假手术组、模型组给予等体积生理盐水腹腔注射，每日 1 次，连续注射 7 d。1.3
5、 跳台实验小鼠置跳台仪中，适应环境 3 min 后，底部栅板通电，记录小鼠跳上平台的时间（反应期）和 5 min 内小鼠遭受的电击数（错误次数）作为学习成绩；24 h 后将小鼠放于平台上，底部栅板通电，记录小鼠跳下平台的时间（潜伏期）及 5 min 内的错误次数，作为记忆成绩。电压 36 V，反应期、潜伏期指标以秒（s）为单位。测验时若小鼠停留在台上超出 5 min，将其取下放入箱内，尾对平台，给予电刺激，记录3潜伏期。1.4 避暗法将小鼠放入明室中，在箱内自由活动 3 min。3 min 内不进入暗室者剔除（预选时不通电）。1 h 后正式进行学习训练，记录小鼠进入暗室遭受电击所需时间为潜伏期
6、，并记录 5 min 内遭电击次数（错误次数）作为学习成绩；24 h 后重复上述过程，记录潜伏期和错误次数作为记忆成绩。电压为 36 V，潜伏期指标以秒（s）为单位。1.5 Morris 水迷宫实验1 w 后进行 Morris 水迷宫实验测试。采用 Morris 水迷宫图像分析系统，在直径 80 cm 圆形水池中设一低于水面 1 cm 透明站台，水温（252），行为测试在安静环境内进行 6 d。前 5 d 进行定位航行实验，将小鼠从东、南、西、北 4 个入水点背对站台轻轻放入水池，同时开始记录小鼠自入水到找到平台所需时间即逃避到平台上的潜伏期，每次间隔 30 s。4 次潜伏期时间的平均值作为当
7、日最终潜伏期时间作最后统计。如果小鼠在 120 s 内未找到平台，其潜伏期按 120 s 计算。第 6 天进行空间探索实验，将水迷宫中的平台撤出，小鼠从平台的对角线处放入，记录小鼠在平台所在象限的时间即穿越有效区的时间和 120 s 内穿越平台的次数。1.6 5 HT 和 DA 的检测将小鼠迅速断头、取脑，放入预先冰冷的生理盐水中，去除脑膜和血管，分出海马，称重后加入预先冰冷的加入少量酸化正丁醇的玻璃匀浆器中，研磨制成匀浆，4 3 000 r/min 离心 15 min，取上清，用荧光分光光度法测 5 HT 和 DA。1.7 HE 染色4水合氯醛麻醉后，迅速剖开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，夹持心
8、尖，自心尖左侧剪开左心室，将大隐静脉穿刺针经左心室插入升主动脉，灌注生理盐水，待血色变淡后，继以 4%多聚甲醛（4）灌注固定，直至动物呈僵硬状态。原位静置 1 h 后取脑，用上述固定液后固定。取视交叉至乳头体组织，常规石蜡包埋，冠状切片，厚度 8 m，进行常规 HE 染色，程序如下：石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待染；切片置苏木素染液 5 min，自来水洗去多余的染料；切片放入盐酸酒精中数秒钟，水洗；切片入氨水溶液中至细胞核变蓝；将返蓝的切片充分水洗，去掉碱性物质，然后入 1%伊红水溶液中 5 min，洗去多余的伊红；显微镜下观察核浆染色对比清晰后梯度酒精脱水、封片。光镜下观察病理形态学变化。
9、1.8 统计学处理数据表达采用 xs，采用 t 检验比较分析。应用 SPSS11.0 软件进行统计学处理。2 结果2.1 bFGF 对拟 VD 小鼠跳台实验的影响与正常组比较，假手术组小鼠学习训练和记忆测试中的各项指标相近，组间比较无显著性差异(P0.05)；模型组小鼠学习训练中反应期延长（P0.01），错误次数增加（P0.01）；记忆测试中潜伏期缩短（P0.01），错误次数增加（P0.01）。与模型组相比，bFGF 组小鼠学习训练中反应期明显缩短（P0.01），错误次数减少（P0.01）；记忆测试的潜伏期延长（P0.01），错误次数明显减少（P0.01）。见表 1。表 1 bFGF 对拟 V
10、D 小鼠跳台实验的影响(略)52.2 bFGF 对拟 VD 小鼠避暗实验的影响与正常组比较，假手术组小鼠潜伏期，错误次数无显著性差异(P0.05)；学习训练中，与正常组比较，模型组小鼠潜伏期延长（P0.01），错误次数明显增加（P0.01）；与模型组比较，bFGF 组潜伏期缩短（P0.01），错误次数明显减少（P0.01）。在记忆测试中，与正常组比较，模型组潜伏期明显缩短、错误次数明显增多（P0.01）；与模型组比较，bFGF 组潜伏期明显延长，错误次数明显减少（P0.01）。见表 2。表 2 bFGF 对拟 VD 小鼠避暗实验的影响(略)2.3 bFGF 对拟 VD 小鼠 Morris 水迷
11、宫的影响定位航行实验：各组小鼠随着训练天数的增加，寻找平台的潜伏期明显缩短。但与正常组比较，假手术组小鼠寻找平台的潜伏期无显著性差异(P0.05)，模型组小鼠寻找平台的潜伏期显著延长（P0.05，P0.01）；与模型组小鼠比较，bFGF组小鼠寻找平台的潜伏期显著缩短（P0.01）。空间探索实验：与正常组比较，假手术组小鼠穿越有效区时间以及穿越平台的次数无显著性差异(P0.05)，模型组小鼠穿越有效区时间明显缩短（P0.01），穿越平台的次数减少（P0.01）；与模型组小鼠比较，bFGF 组小鼠穿越有效区的时间延长（P0.05），穿过平台的次数增多（P0.01）。见表 3。表 3 bFGF 对拟
12、 VD 小鼠寻找平台潜伏期及空间探索实验的影响(略)2.4 bFGF 对拟 VD 小鼠 DA 和 5 HT 的影响与正常组比较，假手术组小鼠海马组织 5 HT 和 DA 含量无显著性差异(P0.05)，模型组小鼠脑海马组织 5 HT 和 DA 含量明显低于正常组（P0.01）；6bFGF 组 5 HT 和 DA 含量均高于模型组（P0.05，P0.01），见表 4。表 4 bFGF 对拟 VD 小鼠海马内单胺类神经递质的影响(略)2.5 海马组织 CA1 区 HE 染色观察正常组：小鼠海马 CA1 区锥体细胞核大而圆，核仁明显，细胞排列较致密整齐，锥体细胞可见多层。假手术组：与正常组无明显差别
13、。VD 模型组：小鼠海马 CA1 区锥体细胞稀疏，层次不清楚；有部分细胞缺失；有的细胞旁有空染区，出现核固缩、胞质浓染、胞体变小。bFGF 组：小鼠海马组织 CA1 区锥体细胞排列尚整齐，层次尚清楚；较少见核固缩现象。3 讨论脑血管病所致脑组织反复缺血再灌注和长期慢性脑灌注不足是 VD 的主要原因9。本实验首选采用清醒小鼠反复结扎双侧颈总动脉的方法建立 VD 模型。目前多用 Morris 水迷宫检验空间学习能力和参考记忆力，跳台实验和避暗实验作为一次性训练被动回避式条件反射方法，能够比较客观地反映动物经过一次电击刺激后记忆获得和巩固情况。本研究通过跳台实验、避暗实验和 Morris 水迷宫实验
14、证明模型小鼠的被动回避反应能力和空间分辨能力均下降，学习、记忆功能明显受损，同时光镜下观察模型组小鼠脑组织海马 CA1 区出现病理形态学的改变，均说明此模型是较为理想的 VD 动物模型。bFGF 组学习记忆能力明显高于模型组，表明 bFGF 能够明显改善 VD 小鼠的智能。在 VD 的发病中，神经递质的改变对疾病的发展程度及预后相当重要。已有资料表明，VD 发病过程中大脑海马的神经递质明显减少，尤其是单胺类神经递质减少与 VD 的智力下降密切相关。多数学者认为中枢神经系统缺血期间单胺的合成及降解均受抑制，同时神经末梢突触7对单胺的贮存和重摄取功能也几乎丧失，这就使缺血前已合成的神经递质大量释放
15、进入细胞间隙，最后这些递质一部分被降解，一部分被带入脑脊液及血液中，致使脑组织中递质含量下降。也有学者认为缺血早期神经元受到缺血的刺激，对神经递质的合成及释放增加，随着神经元破坏加重，其合成及释放又被抑制。本实验中 VD 小鼠脑组织海马区 DA、5 HT 含量明显下降，这与其学习记忆能力下降基本一致10，bFGF 组海马组织 5 HT 和 DA 含量明显提高。本研究显示，bFGF 可以通过上调海马组织 5 HT 和 DA 含量改善 VD 小鼠学习记忆能力，其具体机制尚待进一步研究。【参考文献】1 周惠成，陈景清，曹中昌，等.Alzheimer 病与血管性痴呆的认知及生活功能变化的随访研究J.山
16、东精神医学，2005；18（2）：72 5.2 Roman GC.Vascular dementia may be the most common form of dementia in the elderlyJ.J Neurol Sci，2002；15（203 204）：7 10.3 Fernandez M，Castro J，Molano A，et al.Prevalence of neuropsychiatric symptoms in Alzheimers disease and vascular dementiaJ.Curr Alzheimer Res，2008；5（1）：61 9.4 Springer JE.Nerve growth factors in the central nervous systemJ.Exp Neurol，1998；102（2）：354 65.5 LinD A，Finklestein SP.Basic fibroblast growth f
