《胃肠道间质瘤的ckit基因突变检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胃肠道间质瘤的ckit基因突变检测（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1胃肠道间质瘤的 ckit 基因突变检测作者：杨锋 丁宝国 杨堂斗 贺慧颖 钟镐镐 李燕 郑杰 吴秉铨 【摘要】 目的 探讨 CD117 阳性的胃肠道间质肿瘤（GIST）c kit 基因突变分布及类型。方法 采用免疫组化技术，对 10 例 GIST 标本行 CD117、CD34、SMA 和S 100 检测，以确诊为 GIST；采用 PCR 技术对 CD117 阳性的 GIST 进行 c kit 基因突变检测；采用直接测序方法对突变 c kit 基因 11、9、13 和 17 号的外显子突变进行序列分析。结果 4 例成功提取了肿瘤 DNA，其中 3 例检出了 c kit 基因突变，均分布于第 1
2、1 号外显子，均为 557558（WK）的缺失性突变；其中 2 例为纯合子性突变，1 例为杂合子性突变。结论 CD117 阳性的 GIST 通常有 c kit 基因突变，其 11 号外显子是经典分布热点，变异纯合子和杂合子突变为常见类型。 【关键词】 胃肠道间质肿瘤；DNA 突变分析；c kit 基因 ABSTRACTObjectiveTo explore the locus and types of c kit (CD117) mutations in gastrointestinal stromal tumors (GIST).MethodsSpecimens of 10 GIST cas
3、es were detected immunohistologically for CD117, CD34, SMA and S 100 to confirm the diagnosis of GIST. For CD117 positive GIST, the mutation of c kit was detected by PCR, and its exons 11, 9, 13 and 17 analyzed by direct sequencing technique.ResultsDNA was successfully isolated in four cases, in whi
4、ch, mutation of c kit was found in three cases, all the genes detected were at c kit exon 11 with codon 557-558(WK), homozygous mutation being noted in two cases and heterozygous in one.ConclusionThere is usually c kit gene mutations in CD117 positive GIST, the exon 11 being classic “hot spot” of th
5、e mutations. The homozygous and heterozygous are their common types. KEY WORDSGastrointestinal stromal tumor; DNA mutationa analysis; c kit gene 胃肠道间质瘤（GIST）是近年来被认识并命名的新实体瘤，CD117（KIT 蛋白）是其特异性敏感标志物1。GIST 具有 c kit 基因的 11 号外显子突变，从而导致酪氨酸激酶持续激活2。GIST 对酪氨酸激酶抑制剂 Gleevec 治疗敏感3。基因诊断和分型为临床深入认识该病提供了重要前提4。本文探讨了
6、 GIST c kit 基因突2变分布及类型，现报告如下。 1 材料和方法 1.1 标本及其来源 收集胶南市人民医院外科收治的 10 例临床病理诊断为 GIST 的肿瘤石蜡包埋组织标本，其中男 6 例，女 4 例，年龄 3172 岁。根据临床病理组织学形态特征将GIST 分为：梭形细胞型 4 例，上皮样细胞型 3 例和两者混合型 3 例。肿瘤直径2 cm、核分裂象5/50 HPF（极低度侵袭危险性）3 例，肿瘤直径 25 cm、核分裂象5/50HPE(低度侵袭危险性）2 例，肿瘤直径 510 cm、核分裂象5/50HPF 或肿瘤直径5 cm、核分裂象(610)/50 HPF（中度侵袭危险性）2
7、 例，肿瘤直径5 cm、核分裂象5/50 HPF 或肿瘤直径10 cm 或核分裂象10/50 HPF（高度侵袭危险性）3 例。 1.2 免疫组化方法 将 40 g/L 甲醛溶液固定、石蜡包埋的组织制成 4 m 连续切片，以CD117(A4502，1200)、CD34(M7165，150)、SMA(M851，1100)、S 100(Z231，1200) 进行免疫组化标记。CD117 免疫标记采用 Envision 两步法；余者均采用 SP 三步法5。 CD117 阳性细胞胞膜呈棕黄色；S 100 阳性细胞胞核和胞质呈棕黄色；CD34、SMA 阳性细胞胞质呈棕黄色。 1.3 c kit 基因突变检
8、测分析 用 Qiagen DNA 试剂盒提取石蜡包埋组织的 DNA，行 PCR 扩增。所有病例均首先进行 c kit 第 11 号外显子的扩增检测，发现有突变者，不再进行其他突变检测；对 11 号外显子突变无阳性发现者，再进行 c kit 9 号外显子的扩增检测；无 c kit 9 号外显子突变者，再进行 13 号和 17 号外显子的扩增。所用引物序列、退火温度和 PCR 产物片段大小见表 1。表 1 PCR 扩增引物序列、退火温度和产物片段外显3子编号引物序列（略） PCR 反应条件为：95 变性 2 min；94 40 s，退火 40 s，72 35 s，循环 3035 次；最后 72 延
9、伸 5 min。以双蒸水代替模板作为阴性对照。 PCR 产物由北京华大中生生物科技发展公司纯化并测序（ABI 3100 测序仪）。有突变的病例再行反向测序证实，并与 NCBI 基因库 c kit 基因序列进行比对。 2 结果 经免疫组化检测 CD117、CD34、SMA 和 S 100，确认 10 例为 CD117 阳性 GIST病例。 10 例石蜡标本中仅 4 例成功提取了 DNA，并进行了 PCR 扩增和测序。按细胞类型分为上皮样细胞 2 例，梭形细胞 1 例，混合型 1 例。按侵袭危险性分为高度危险性 3 例，其核分裂象(815)/50 HPF；中度危险性 1 例，其核分裂象(12)/5
10、0 HPF。该 4 例中，有 3 例检出了 c kit 基因第 11 号外显子缺失突变，均为累及557558（WK）的缺失性突变。其中 1 例 CD117（+）、CD34（ ），第 11 号外显子缺失突变，缺失片段为 TGGAAGG，为杂合子性缺失突变；1 例 CD117（ ）、CD34（ ），第 11 号外显子缺失突变；1 例 CD117（ ）、CD34（ ），第 11 号外显子缺失突变。后两者均为纯合子性缺失突变。1 例 CD117（+）、CD34（ ），未检测到11、9、13、17 号外显子的突变，属野生型序列。其余 6 例，经反复提取 DNA 和检测，均失败。 3 讨论 本组 10 例
11、 GIST 的组织病理学研究显示，GIST 肿瘤细胞主要有 3 种类型：梭形细胞型、上皮样细胞型和梭形细胞与上皮样细胞混合型，但主要以梭形细胞型为常见。组织学检查表明，GIST 肿瘤细胞的核分裂象数目差异很大，而且与肿瘤的大小不相关。光镜高倍视野下 GIST 肿瘤细胞核分裂象数目与肿瘤大小，均为4FLETCHER 等6对 GIST 侵袭危险度分级的主要指标，在评估病人预后上有重要意义。 本文研究结果进一步表明，免疫组织化学几项检测指标，特别是 CD117 和 CD34对 GIST 的诊断是必需的。95以上 GIST 表达 CD117 阳性，70左右表达 CD34阳性。因此，CD117 和 CD
12、34 是 GIST 病理诊断和鉴别诊断的关键性免疫形态学指标。GIST 从组织学上，被认为来源于胃肠道间质中的 Cajal 细胞和其前身细胞7，这两种细胞都显示 CD117 和 CD34 阳性表达；SMA 和 S 100 则是用于鉴别平滑肌和神经源性肿瘤的免疫学指标。 本研究对 10 例 GIST 组织进行 c kit 基因突变检测分析，目的是揭示肿瘤赖以发生的突变基因靶点，寻找在基因水平上的序列异常改变，帮助临床选择恰当治疗方案。但是，其中 6 例检测失败。分析失败原因，主要是组织标本处理不规范，造成无法有效提取组织 DNA。因此，规范 GIST 的组织处理过程，是必须首先解决的问题。 本组
13、 GIST 中有 3 例为 c kit 基因突变肿瘤，突变位点均位于 11 号外显子，并表现为纯合子缺失突变和杂合子缺失突变两种类型。c kit 基因是一种原癌基因，它的配体是细胞因子，c kit 基因被激活后会引起受体的二聚体，并促进酪氨酸磷酸化，启动细胞内的信号传导，产生一系列增殖、分化、凋亡的调节功能。c kit 基因 11 号外显子是酪氨酸激酶抑制剂的靶向位点，因此是 Gleevec 药物作用的敏感位点。按基因分类诊断，是推荐选择 Gleevec 靶向治疗药物的适宜对象。而另 1 例病人的基因突变检测未发现 c kit 基因 9、11、13、17 号外显子突变，基因类型为野生型。同时，
14、根据其肿瘤大小和核分裂象分级，属高侵袭危险性 GIST 者，免疫组织化学检测其 CD117 和 CD34 均为阳性，属对靶向治疗药物 Gleevec 不敏感的5GIST 肿瘤病人。因此，基因诊断分型是 GIST 的重要临床指标，为临床治疗提供依据，有重要意义。 【参考文献】 1SARLOMO RIKALA M, KOVATICH A J, BARUSEVICIUS A, et al. CD117: a sensitive marker for gastrointestinal stromal tumors that is more specific than CD34 J. Mod Patho
15、l, 1998,11:728 734. 2HIROTA S, ISOZAKI K, MORIYAMA Y, et al. Gain of function mutations of c kit in human gastrointestinal stromal tumorsJ. Science, 1998,279:577 580. 3OLEARY, JULEO J. Gartromtertinal stromal tumor: answers and questionJ. Human Lathology, 2002,33(5):456 458. 4贺慧颖,项一宁,李燕,等. 胃肠道间质瘤 60
16、 例中 c kit 和 PDGFRA 基因突变 J. 北京大学学报：医学版, 2005,37(3)：320 324. 5纪祥瑞,姜天福,李玉军,等. 血管免疫母细胞性淋巴结病病变性质的研究J. 青岛大学医学院学报, 2004,40(1):1 7. 6FLETCHER C D, BERMAN J J, CORLESS C, et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumor: a consensus approachJ. Hum Pathol, 2002,33:459 465. 7SEIICHI H, KOJI I. Pathology of gastrointestinal stromal tumorsJ. Pathology International, 2006,56:1 9.
