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1、1种植于硅橡胶膜上的大鼠纤维环细胞的 表型特征研究作者：郭志良，周跃，成敏，曹国永，李华壮，滕海军【关键词】 纤维环细胞；硅橡胶膜；逆转录Phenotypic characteristics of rat annulus fibrosus cells cultured on flexible silicone membranes【Abstract】 AIM: To compare the phenotypic characteristics of rat annulus fibrosus (AF) cells cultured on flexible silicone membranes wi
2、th the same cells cultured in plastic plates. METHODS: The morphology of AF cells cultured in different substrates was observed under an inverted phasecontrast microscope and a transmission electron microscope. Proteoglycan was stained with toluidine blue for observing its expression. The contents o
3、f collagen type, and aggrecan mRNA were determined by RTPCR. The expression of integrin 1 was monitored by flow cytometry. Cell adhesion to silicone membranes was also measured. RESULTS: The AF cells cultured in different substrates were morphologically undistinguishable. Toluidine blue staining sho
4、wed that there was also no difference between AF cells cultured on flexible silicone membranes and in plastic plates. The cells growing in different substrates expressed the same levels of collagen type, and aggrecan mRNA and integrin 1. AF cells grew well on silicone membranes. CONCLUSION: AF cells
5、 cultured on flexible silicone membranes maintain the stability of phenotype and may be appropriate for further studying the metabolic responses to mechanical stimuli at the cellular level.【Keywords】 annulus fibrosus cell; silicone membrane; reverse transcriptasepolymerase chain reaction; flow cytom
6、etry【摘要】 目的：比较种植于硅橡胶膜或塑料培养板的大鼠纤维环细胞的表型特征. 方法：利用倒置相差显微镜及透射电镜观察种植于不同基质的大鼠纤维环细胞形态的变化；利用甲苯胺蓝染色观检测蛋白多糖的表达情况；通过 RTPCR 法检测，型胶原及聚集蛋白聚糖 mRNA 的表达情况；采用流式细胞术观察细胞表2面整合素 1 的表达情况；同时检测了纤维环细胞在硅橡胶膜上的黏附情况. 结果：种植于不同基质的纤维环细胞形态学观察无明显差别；在两种基质上的纤维环细胞甲苯胺蓝染色无差异；，型胶原及聚集蛋白聚糖 mRNA 及细胞膜整合素 1的表达亦无明显差异；纤维环细胞可以黏附于硅橡胶膜上生长. 结论：种植于硅橡胶
7、膜上的纤维环细胞表型特征无改变，为进一步研究力学刺激对纤维环细胞的影响提供实验基础.【关键词】 纤维环细胞；硅橡胶膜；逆转录聚合酶链式反应；流式细胞术0 引言下腰痛是一个重要的公共卫生问题，虽然引起下腰痛的原因很多，但是椎间盘退变仍是其主要因素1-2. 目前的观点认为，椎间盘退变是一个由生物化学和生物力学因素相互作用的复杂的病理过程. 由于椎间盘周围的肌肉、韧带以及椎间盘内的静水压等因素，椎间盘始终处于负荷状态，尤其是椎间盘纤维环细胞总是不断地受到不同形式的拉伸应力. 为了从细胞水平研究生物力学因素对细胞的影响，很多研究者设计出不同的实验装置，对体外培养细胞施加不同形式的拉伸应力3-4. 我们
8、也自行设计一套对单层生长细胞进行周期性张应变的实验装置，为对细胞施加张应力，首先需要将纤维环细胞培养于弹性硅橡胶膜上，因此有必要对培养于新的基质上的细胞表型稳定性进行确认. 细胞生长基质可影响细胞外基质成分的表达，本实验我们比较了培养于硅橡胶膜和细胞培养板上的纤维环细胞的细胞外基质成分的表达情况.1 材料和方法1.1 材料 SD 大鼠(1 月龄)由本院实验动物中心提供. DMEM 培养基和型胶3原酶为 Gibco 公司产品，胎牛血清为 PAA 公司产品，纤维连接素为 Roche 公司产品，Hepes 为 Amresco 公司产品，TRIzol 试剂为 Invitrogen 公司产品，一步法RT
9、PCR 试剂盒为 Qiagen 公司产品，FITC 标记抗整合素 1 单抗为 BD 公司产品. 硅橡胶膜为 Dow Corning 公司产品，细胞培养板为 Corning 公司产品，凝胶成像系统为 Alpha Innotech 公司产品，流式细胞仪为美国 BD 公司，透射电镜为日立公司产品.1.2 方法1.2.1 纤维环细胞的分离培养参考文献5方法，大鼠处死后，常规消毒，无菌条件下取下脊椎，立即置入盛有 PBS 液的培养皿中，去除椎间盘周围的软组织，将 L5L10 椎间盘从中间切开，小心刮除髓核组织，然后用尖刀片将纤维环仔细取下，于 PBS 液中漂洗三遍，然后用眼科剪剪成 1 mm1 mm1
10、mm 的小块，置2.5 g/L 胰蛋白酶中，37下 10 min，加入含血清培养基终止消化，用 PBS 液清洗去除胰蛋白酶，将组织块置 1 g/L 的胶原酶溶液中，37下消化 2 h, 200 目滤网过滤，细胞悬液 1000 r/min 离心 5 min，得细胞团，PBS 液清洗细胞三次，清洗后的细胞，以 DMEM（含 100 mL/L 的胎牛血清，20 mmol/L HEPES, 100 万 U/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素）悬浮，接种于培养瓶中，置 37，50 mL/L CO2 培养箱中培养. 待细胞生长汇合时，用胰蛋白酶消化，传代细胞接种于细胞培养板和自制的细胞培养槽中，培养槽
11、的底由硅橡胶膜制成，用 5 g/cm2 的纤维连接素包被.1.2.2 甲苯胺蓝染色和透射电镜观察单层生长的细胞用 40 g/L 多聚甲醛固定，0.4 g/L 甲苯胺蓝染色，蛋白多糖为深紫色. 通过离心的方法收集细胞团块，用戊二醛和锇酸固定，透射电镜观察.41.2.3 逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）细胞总 RNA 的提取采用 TRIzol 试剂，根据操作说明书进行. 紫外分光光度计分别于 260 nm 和 280 nm 波长测定 RNA的纯度（A260 nm/A280 nm=1.82.0）及定量. 目的基因的扩增采用一步法 RTPCR试剂盒，所用引物情况：型胶原（上游：5ggtcacagca
12、gactggaaacatcg3，下游：5agggtagggagcagcagcaagag3；产物长度：487 bp；退火温度：54）；型胶原（上游：5cgaggtgacaaaggagaagc3，下游：5ctggttgttcagcgacttga3；产物长度：453 bp；退火温度：55）；可聚蛋白聚糖核心蛋白（上游：5cgcttgccagggggagttgtattc3，下游：5ggaggccagggtagcattttgagc3； 产物长度：405 bp；退火温度：55）；GAPDH（上游：5tgctgagtatgtcgtggagt3，下游：5agtctt ctgagtggcagtgat3； 产物长
13、度：287 bp；退火温度：51）. 反应条件为：50，30 min；15， 15 min；94， 1 min；退火温度，45 s；72，1 min；30 循环；72，10 min. PCR 产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，摄像后用图像分析软件进行条带灰度分析. 结果用目的条带和 GAPDH 条带的灰度比值表示.1.2.4 流式细胞术单层生长的细胞用 PBS 洗 2 遍，然后通过消化和离心的方法收集细胞，细胞用 FCM 缓冲液（含 20 g/L 牛血清白蛋白和 0.1 g/L 叠氮钠无Ca2+，Mg2+的 PBS）重悬，调整密度为 109/L，细胞用 FCM 缓冲液洗涤后，进行抗体孵育.
14、 离心后的细胞中加入 200 L (50 mg/L，用 FCM 缓冲液稀释) FITC 标记的抗整合素 1 抗体，4避光孵育 30 min，然后用 PBS 洗涤 3 次，上流式细胞仪检测，激发波长为 488 nm. 每组样本检测 10 000 个细胞，所测得细胞荧光强度代表了整合素 1 的表达情况. 同时，做阴性对照实验.1.2.5 细胞贴壁情况为检测细胞在硅橡胶膜上的黏附情况，我们分别在细胞接种后的 3，6，12 和 24 h，对贴壁细胞进行计数，细胞贴壁率为贴壁细胞数与总细5胞数之比. 细胞接种 48 h 后，进行换液，然后对细胞施加 3，6 和 12 h 的应变为 10%，频率为 2 H
15、z 的周期性张应变. 受力后对培养基中的脱落细胞进行计数，然后将仍然贴壁的细胞消化下来进行计数，计算脱落细胞和贴壁细胞的比值，与未受力组相比较.统计学处理：所有实验均重复 3 次，结果用 xs 表示，统计分析采用独立样本t 检验和 2 检验，P0.05 为有统计学差异.A：培养板上细胞； B：硅橡胶膜上细胞.图 1 倒置相差显微镜观察纤维环细胞的形态200（略）2 结果2.1 细胞形态和结构高密度接种的原代纤维环细胞，在 2 wk 生长汇合，然后将细胞消化下来，传代至硅橡胶膜或细胞培养板上. 在这两种培养条件下，细胞均呈现圆形或多角形，单层生长，两者之间无形态上的差异（图 1）. 第一代细胞生
16、长速度加快，大约 1 wk 可生长汇合，本实验仅使用第一代细胞.透射电镜观察培养纤维环细胞，可见其具有软骨细胞的结构特征，在两基质上生长的细胞在超微结构上未显示出差异（图 2）.A：培养板上细胞； B：硅橡胶膜上细胞.图 2 生长于不同基质的纤维环细胞的超微结构6000（略）2.2 细胞外基质的表达情况无论是生长在培养板的纤维环细胞还是硅橡胶膜6上小细胞，两者表现出相同的对甲苯胺蓝的异染性（图 3）.A：培养板上细胞； B：硅橡胶膜上细胞.图 3 不同基质培养的纤维环细胞甲苯胺蓝染色200（略）通过对培养于不同基质的纤维环细胞型胶原、型胶原和可聚蛋白聚糖核心蛋白 mRNA 的检测，在 mRNA 水平，未检测出在不同的培养基质生长的细胞，细胞外基质表达的不同（P0.05，图 4，5）. 1, 4：型胶原; 2, 5：型胶原；3, 6：可聚蛋白聚糖.图 4 不同培养基质上的纤维环细胞型胶原、型胶原和可聚蛋白聚糖核心蛋白 mRNA
