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1、1HPLC 法检测血清中伏立康唑含量的研究【摘要】 目的 建立人体血清样本中伏立康唑含量检测方法。方法 色谱柱为依利特 C18 柱（5m，4.60mm200mm）；流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；检测波长:258nm。结果 伏立康唑在0.1413.96g/ml 浓度范围内呈良好的线性关系，r=0.998。结论 实验建立的HPLC 方法可以用于血清样本中的伏立康唑含量检测。 【关键词】 伏立康唑 血清样本 HPLC 含量测定【Abstract】 Objective To establish a method to determinate t
2、he voriconazole content in human serum samples.Methods Eliter C18 column （200mm4.6mm,5m） was used with the mobile phase of water-acetonitrile-acetic acid-triethylamine （64:36:0.1:0.05）.The flow rate was 1.2ml.min-1and the wave-length was 258nm. Results The calibration curve was linear in the range o
3、f 0.14-13.96g/ml（r=0.998）. Conclusion The established HPLC method can be used in the determination of voriconazole content in human serum.【Key words】 voriconazole; serum sample;HPLC;determination伏立康唑（voriconazole,VRC）是一个三唑类抗真菌药物，其作用机制是抑制真菌细胞色素 p450 依赖的 14-固醇脱甲基酶，而本品对于真菌细胞色素 p450 酶比对各种哺乳动物的细胞色素 p450
4、酶系统更具选择性。伏立康唑在 0.0364g/ml 的浓度范围内对几乎所有的实验真菌，包括致病性酵母菌和丝状菌属及双芽生菌的分离菌株均有作用。对一些条件致病真菌如曲霉菌属、隐球菌属及念珠菌属包括对氟康唑耐药的克柔念珠菌均有抗菌活性。本实验旨在建立血清样本中伏立康唑浓度检测方法。21 实验材料伏立康唑对照品，中检所提供。卡马西平对照品，中检所提供。乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20051120。冰醋酸：分析纯，天津市化学试剂三厂，批号：20061228。三乙胺：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂，批号：20040806。Waters515 高效液相泵，717 自动进样器，99
5、6 紫外检测器，Empower 色谱工作站。2 色谱条件及血浆样本处理方法142.1 色谱条件 色谱柱为依利特 C18 柱（5m，4.60mm200mm）；流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；检测波长：258nm；柱温：室温。2.2 标准液制备 精密称取伏立康唑对照品 0.0340g，加甲醇溶解于 50ml 容量瓶中并稀释至刻度,即得 698g/ml 的伏立康唑对照品溶液。精密称取卡马西平对照品 0.0050g，用流动相溶于 100ml 容量瓶中并稀释至刻度，即得 50g/ml 的内标溶液。2.3 血浆样品的处理 取血浆 0.2ml，内标 1
6、0l（卡马西平 50g/ml），混匀，再加入 0.5ml 甲醇，旋涡振荡 0.5min，16000r/min 离心 5min; 吸取上清液 100l 进样。3 方法学研究3.1 专属性 在选定的色谱条件下，伏立康唑与内标卡马西平完全分离，且峰形良好，两者保留时间分别约为 8.4min 和 5.4min，空白血浆、空白血浆加药物及内标、含药血浆加内标按 4 法处理后，色谱图见图 1。: 空白血浆；: 空白血浆加3药；:含内标血浆；IV：2 号受试者用药后 2h 色谱图A：卡马西平, B：伏立康唑图 1 伏立康唑色谱图 3.2 标准曲线及线性回归方程 用伏立康唑对照品溶液（698g/ml）配制标准
7、曲线工作液：将 698g/ml 对照品溶液依次用流动相稀释，得到 2.79、8.37、27.92、55.84、139.60、279.20g/ml。取空白血浆 0.19ml 分别置于系列试管中，分别加上述标准曲线溶液各 10l，配制成血浆浓度为样，按上 0.14、0.42、1.40、2.79、6.98、13.96g/ml 的血浆标述 4 方法处理血浆样品，测定样品及内标的峰面积，计算其峰面积比值（伏立康唑/卡马西平，A），以峰面积比值 A 对血浆浓度 C 进行线性回归分析，求得线性回归方程为： C = 5.117 A +0.024 （w=1/cc），r=0.998。结果表明，伏立康唑血浆浓度在0
8、.1413.96g/ml 浓度范围内，线性关系良好，血浆样品可进行定量检测的最低浓度为 0.14g/ml。见图 2。图 2 伏立康唑血浆标准曲线3.3 绝对回收率 各取空白血浆 0.19ml 于 15 个空白试管中，5 个为一组，分别加入 8.37g/ml（低浓度）、55.84g/ml（中浓度）、139.60g/ml（高浓度）伏立康唑对照品溶液 10l。得浓度为 0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml 的血浆样品。按上述 4 方法处理血浆样品，进样 100l，记录色谱峰面积。 另外，用纯水代替血浆重复以上步骤，记录色谱峰面积。以此为标准，将两组峰面积进行比较，计算伏立康唑的绝对回
9、收率，结果见表 1。3.4 相对回收率试验 各取空白血浆 0.19ml 于 15 个空白试管中，5 个为一组，分4别加入 8.37g/ml、55.84g/ml、139.60g/ml 伏立康唑对照品溶液 10l，得浓度为0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml 的血浆样品。按上述 4 方法处理血浆样品，进样100l，记录色谱峰面积的比值。将比值代入标准曲线，与理论值进行比较，计算伏立康唑的相对回收率，结果见表 1。3.5 精密度试验 取空白血浆 0.19ml 置于离心管中，分别加入已配制好的8.37g/ml、55.84g/ml、139.60g/ml 伏立康唑对照品溶液各 10l，按上
10、述 4 血浆样品处理方法处理后，得血浆浓度为 0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml 的血浆标样各 15 份，按上述 4 方法处理血浆样品，于同日和连续 2 日内各进样 100l，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值（A），并按回归方程求出对应浓度，以此计算其日内和日间变异，结果见表 2。 表 1 回收率试验表 2 精密度试验3.6 稳定性试验 取空白血浆 0.19ml 置于离心管中，分别加入已配制好的8.37g/ml、55.84g/ml、139.60g/ml 伏立康唑对照品溶液各 10l，得血浆浓度为0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml 的血浆标样各 20
11、份，分别于配制后立即、室温放置 4h 后，24h 后反复冻融三次和 1 个月后，按上述 4 血浆样品处理方法处理，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值（A），并按回归方程求出对应浓度并比较测定浓度，以考察样品稳定性。结果见表 3。4 结果测定血清样品中均匀加入低、中、高对照样品，以评价测定结果的准确性。配制方法：取空白血浆 0.19ml 置于离心管中分别加入已配制好的8.37g/ml、55.84g/ml、139.60g/ml 伏立康唑对照品溶液各 10l，得血浆浓度为50.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml 的血浆标样，按上述 4 血浆样品处理方法处理后，进样 100l，结果
12、见表 4。5 结论本实验建立起的 HPLC 检测伏立康唑血清样本含量的方法可行，检测的数据真实可靠，可以作为血清样本中伏立康唑含量测定方法。表 3 样品稳定性试验表 4 血清样品中伏立康唑检测结果【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典, 2005 版.北京:化学工业出版社,2005，附录：28-30.2 Dominique Leveque, Yasmine Nivoix , Francois Jehl ,et al. Clinical pharmacokinetics of voriconazole. International Journal of Antimicrobial A
13、gents, 2006,（27） :274-284.3 G Srinubabu, Ch AI Raju, N Sarath,et al. Development and validation of a HPLC method forthe determination of voriconazole in pharmaceutical formulation using an experimental design. Talanta ,2007,（71）:1424-1429.4 Stephanie Chhun, Elisabeth Rey, Agnes Tran,et al. Simultaneous quantification of voriconazole and posaconazole in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultra-violet detection. Journal of Chromatography B, 2007,（40） :001-006.
