《汉防己甲素干预白血病细胞获得性多药耐药的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《汉防己甲素干预白血病细胞获得性多药耐药的研究（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、江苏大学硕士学位论文摘要目的：1 运用化疗药物阿霉素( d o x o m b i c i n ，D O X ) 处理白血病细胞株心6 2 ，诱导获得性耐药的产生，以此模型为基础将中药汉防己甲素( t e t r a n 嘶n e ，1 m ) 与诱导剂量的阿霉素联合作用于1 6 6 2细胞，观察细胞m d r l 基因和P - 糖蛋白( P g l y c o p r o t e i n ，P - g p ) 表达水平，检测P g p 的功能状态，验证汉防己甲素对阿霉素诱导的多药耐药的干预效果；2 从m d r l 基因的转录调控机制着手在基因、蛋白表达以及转录因子活性三个水平探讨汉防己甲素
2、干预m d r l 基因过表达的机制，并初步探讨细胞凋亡在耐药干预过程中的作用。方法：1 采用四唑蓝( M T T ) 比色法观察汉防己甲素对白血病细胞l 为6 2 的毒性作用，计算并选取汉防己甲素对飚6 2 细胞的I C 5 、I C l o 、I C 2 0 进行以下实验；2 以O 瞰咖l 阿霉素单用或O 舡m l 阿霉素联合不同浓度的汉防己甲素( O 5 、1 毗m l 、2 毗m 1 分别为I C 5 、l C l o 、I C 2 0 ) 为处理因素作用于飚6 2 细胞；3 采用逆转录多聚酶链反应( 1 灌P C R 法) 检测m d r l 、N F 1 C B 、c - j u
3、n 、Y B 1 、s u r v i v i n 基因的m R N A 表达水平；4 用流式细胞术( n o wc y t o m e t 巧，F C M ) 检测各组细胞的P - g p 表达水平；5 用胞内罗丹明1 2 3 ( R h 0 1 2 3 ) 潴留试验检测处理前后P g p 的功能状态；6 用免疫印迹反应( W r e s t e mb l o t法) 检测飚6 2 细胞中转录因子N F K B 、c - j u n 、1 的核内蛋白表达量的改变；7 用凝胶迁移滞后实验( E M S A ) 方法检测各组细胞中转录因子N F 1 ( B 、c i u n 与D N A 的结合
4、活性；8 用A n n e x i nV 法江苏大学硕士学位论文检测阿霉素和汉防己甲素分别单独作用以及两者联合作用对瞄6 2 细胞凋亡的影响。结果：1 与空白对照飚6 2 细胞相比，O 舡m l 阿霉素作用2 4 h可诱导m d r lm R N A 表达的上调( 尸 O 0 5 ) ，1 m l 汉防己甲素与阿霉素联合作用后m d r lm 对妊的表达低于阿霉素单独作用组( P O 0 5 ) ，阿霉素单独作用组与联合作用组的Y B 1 蛋白细胞核内表达分别比空白对照组上调了2 7 2 、2 8 0 倍；7 阿霉素单独作用组s u r v i v i nm R N A 表达与空白对照组无明显
5、变化俨 O 0 5 ) ，汉防己甲素与阿霉素联合作用组s u i v i nm R N A 表达较阿霉素单独作用组和空白对照组减少( P O 0 5 ) 1 m l t e t r a n d r i n ec a ni n h i b i tt h ed o x o r u b i c i n - i n d u c e do V e r e x p r e s s i o no fm d r lm R N A 俨 O 0 5 ) ；V l江苏大学硕士学位论文2 W et h e nc h o s e 犁m l t e t r a n d r i n ef o rf u n h e rs t
6、 u d y T h ee X p r e s s i o nl e v e lo fP g pi nK 5 6 2c e l l st r e a t e dw i t hd o x o m b i c i no n l yw a sm u c hh i g l l e rt h a nt h ec 伽t r o l ( P O 0 5 ) ；4 A f t e rt r e a t e dw i t h0 耻m ld o x o m b i c i n ，t h ee x p r e s s i o nl e V e l so fN F 一1 出m R N Aa n dn u c l e
7、a rp r o t e i ni n c r e a s e d ( P O 0 5 ) c o m p a r e dw i t hO 瞰g m ld o x o l l l b i c i nt r e a t e do n l y I nc e l l st r e a t e dw i t h w i t h0 舡m ld o x o m b i c i no rb o t hO 印m ld o x o r u b i c i na n d 犁m lt e t r a n d r i n et h ee x p r e s s i o nl e V e lo fY B 一1n u c
8、 l e a rp r o t e i nw a sr e s p e c t i V e l y2 7 2 、2 8 0t i m e sa st h ec o n t r o l ；7 A 血e rt r e a t e dw i t hO 鳅m ld o x o m b i c i n ，t h ee x p r e s s i o no fs u r v i V i nm R N Ah a dh a r d l ya n yc h a n g e s ( P O 0 5 ) A n e rt r e a t e dw i t hO 6 “g m ld o x o m b i c i n
9、a n d犁m lt e t r a n d r i n et h ee x p r e s s i o no fs u r v i V i nm R N Aw a si n h i b i t t e d ( 尸l 0 0 5 ) ，联合作用I I 组与阿霉素单独作用组和空白对照组比较差异均具有统计学意义( P O 0 5 ) ，与阿霉素单独作用组比较差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。说明联合作用l I l 组P g p 的功能与空白对照组接近，明显低于阿霉素单独作用组。以上结果提示阿霉素单独处理后飚6 2 细胞内药物积聚减少，产生耐药；1 m 与阿霉素联合作用后细胞内药物积聚较阿霉
10、素单独作用增加，接近于空白对照组，恢复细胞的药物敏感性。空臼对照组| 5 司霉系单独作用组联合作用l I I 组图2 - 31 D 对K 5 6 2 细胞内l 强0 1 2 3 积聚的影响2 4 讨论在肿瘤的治疗方法中，化疗占据着不可替代的地位。自从化疗药物应用于临床以来，虽对少数恶性肿瘤的治疗取得了成功，但在大多数恶性肿瘤中收效却不大，这其中一个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性( M D R ) 。1 5江苏大学硕士学位论文近十余年来，国内外学者致力于肿瘤耐药逆转的研究，相继开发了一、二、三代耐药逆转剂，但未见成功的临床应用报道。将研究方向从耐药逆转转为耐药形成过程中的干预可能
11、是提高肿瘤疗效的一条新思路。体外试验中，P S C 8 3 3 、v X 7 1 0及X R 9 5 7 6 能阻止m d r l 基因的表达，干预化疗药物诱导性多药耐药的产生，但上述药物未能在临床上成功应用，而且未对m d r l 基因表达下调的机制作进一步的探究。阿霉素是临床常用化疗药物之一，属葸环类，可直接嵌入D N A 碱基之间，干扰转录过程，阻止m R N A 的形成，抗瘤谱广，能抑制D N A 和R N A 的合成，属周期非特异性药物。阿霉素可使飚6 2 细胞产生诱导性耐药，而且这种耐药表达在一定条件下可转化为组成性表达。我们的前期研究已经证实0 鳅g m l 阿霉素作用2 4 h
12、 可以诱导l 西6 2 细胞M D R 的发生，我们以此为耐药诱导模型进行耐药形成干预的研究。T r D 是一种低毒的中药类钙通道阻滞剂，国内外文献报道，1 r D 在体内、外均能明显下调耐药细胞的m d r lm R N 胛g p 的表达，有效逆转白血病细胞的耐药性，丌D 临床常规剂量为6 0 1 2 0 m d ，耐药逆转临床试验中T T D 用量达到2 4 0 m 鲋，患者未出现心悸、胸闷等不适反应，多次检查心电图均未发现异常，亦未出现肝、肾毒性及其它不良反应。本研究着眼于将订D 应用于化疗初始干预阿霉素诱导的M D R 的形成，摸索出最佳作用条件并初步探讨其作用机制。X i uF H
13、u 等在应用环胞素A 预防表柔比星诱导的M D R 产生的研究中发现当环胞素A 预处理4 h 以上时有更好的预防作用【4 9 】。我们选取0 舡咖l 、1 毗g m l 、2 即m lT r D ( 此三个药物浓度对细胞无明显毒性) 分别对飚6 2 细胞预处理2 4 h ，再与0 似g m l 阿霉素共同作用2 4 h 以观察下r D 干预耐药形成的效果。阿霉素作用后m d r lm R N A 及其编码产物P - g p 表达明显增加，P g p 的药物外排功能增强，导致细胞内药物积聚减少，产生耐药；1 r D 与阿霉素联合作用后阿霉素诱导的m d r lm R N A 表达随r r D 浓
14、度的增加而逐渐减弱，其中2 毗咖l1 r D 抑制作用最为明显，P g p 的表达减少，药物外排功能降低，表明T T D 可干预阿霉素诱导的M D R的形成。本研究利用中药汉防己甲素进行了耐药干预的研究，研究结果表明汉防己甲素可应用于化疗初始干预阿霉素诱导的白血病细胞M D R 的产生，从而为临床化1 6江苏大学硕士学位论文疗提供新的治疗策略。体外逆转耐药实验中所用汉防己甲素浓度为6 舡咖l ，本实验汉防己甲素干预耐药形成的最佳作用浓度为2 毗咖l ，说明预防剂量明显低于耐药逆转时所用剂量，应用于临床毒性将更低，故将汉防己甲素用于临床预防耐药具有良好的应用前景。2 5 本章小结本实验应用中药汉
15、防己甲素与化疗药物联合作用于白血病细胞，以观察联合用药及化疗药物单独应用时细胞多药耐药发生发展的差异。耐药是肿瘤难治和复发的原因之一，分为原发耐药和获得性耐药，原发耐药是指第一次化疗开始肿瘤细胞即对化疗药耐药而使用多种化疗方案治疗效果均不佳，而获得性耐药是指肿瘤细胞开始对化疗药物敏感而化疗一段时间后肿瘤细胞发生分子生物学改变对一开始敏感的药物耐受，致使化疗失败，肿瘤复发。对于原发耐药可以用耐药逆转剂跟化疗药物联合作用，以提高化疗药物对耐药肿瘤细胞的杀伤作用，而对于获得性耐药，虽然研究者们也进行了相关逆转的实验，但耐药是化疗一段时间后细胞发生的转化，如果我们能预防或延缓此过程的发生，那么就可以减
16、少肿瘤化疗后的复发，减轻患者的负担提高生活质量。已有研究者试图干预耐药的形成过程，但因为药物的副作用，没有进行体内实验以及未对预防机制作进一步研究等未能在临床上成功应用，我们的实验选择了低毒的中药逆转剂应用于耐药诱导的过程中以观察对耐药形成的影响，实验结果表明汉防己甲素的确能干预白血病细胞多药耐药的形成，并且成浓度依赖性，2 陬咖l 为对本实验所选取模型的最佳作用浓度，体外逆转耐药实验中所用汉防己甲素浓度为6 和g m l ，预防剂量明显低于耐药逆转时所用剂量，应用于临床毒性将更低，故将汉防己甲素用于临床预防耐药具有良好的应用前景。但仍需对汉防己甲素干预耐药的机制作进一步研究，为临床应用提供理论基础。1 7江苏大学硕士学位论文第二部分汉防己甲素干预白血病细胞多药耐药的机制探讨白血病细胞多药耐药( m u l t i d l l l gr e
