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1、烟台大学硕士学位论文海参肽的酶法制备工艺及抗疲劳活性研究姓名：王洪涛申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：金海珠20070401I摘 要 本文以鲜海参为原料，研究了利用复合胰蛋白酶水解制备海参肽的工艺，并通过超滤和高效液相色谱相结合的方法测定了海参肽的分子量分布，最后对所得海参肽进行了抗疲劳活性研究。 在酶解工艺优化的研究中，从反应体系的 pH、底物浓度、加酶量、反应时间和温度等因素着手，以多肽得率为指标，研究了复合胰蛋白酶酶解海参蛋白的最佳条件，然后在最优酶解条件下酶解制得了海参肽的粗品。同时，从综合利用海参营养成分的角度考虑，分离纯化出了海参多糖。实验结果表明：在不调节体系 pH 的条
2、件下，复合胰蛋白酶酶解海参蛋白的最佳酶解条件为：底物浓度 1%，加酶量 8000U/g，酶解温度 50，水解时间 2h。在此条件下进行酶解，多肽得率可以达到 34.26%。将粗多糖分离纯化后，以鲜品海参的重量计，多糖得率为 0.402%。 海参肽粗品用超滤膜纯化后，用凝胶柱进行高效液相层析，得出了海参肽分子量分布的图谱，结果表明，水解获得的海参肽的分子量较为接近，集中度较高，都在 1600Da以下，其中分子量小于 1000Da 的占到了 72.07%。同时说明采用超滤法可以有效去除酶解液中的大分子蛋白。 动物实验证明，海参肽对小白鼠的体重无显著影响，能明显延长小白鼠的负重游泳时间和转棒时间，显
3、著降低运动后小鼠的血尿素氮含量，提高其肝糖原含量，具有增加小鼠运动耐力、促进糖原储备、加速机体的尿素氮代谢的作用，抗疲劳活性非常显著，且功效随着灌胃剂量的提高而增强。 关键词：生物活性肽 海参 酶解 分子量分布 抗疲劳 IIAbstract The thesis was about the enzymatic preparation of bioactive peptides from sea cucumber and its molecular weight distribution determined by ultra-filtration and HPLC, the anti-fati
4、gue action of which was studied as well. Studies of enzymatic hydrolysis were mainly on the effect of pH, concentration of substrate, dosage of enzyme, hydrolysis time and temperature on the yield of polypeptide, and the crude sea cucumber peptide was made under the optimum hydrolytic condition. In
5、order to multiply utilize the nutritional ingredients of sea cucumber, the polysaccharide was purified. The experimental result is as follows: the concentration of substrate is 1%, the dosage of protease is 8000U/g, temperature is 50 and hydrolysis time is 2h. Under this condition, the yield of poly
6、peptide is 34.26%. After separation and purification, the yield of polysaccharide is 0.402%（compared with fresh sea cucumber）. Gel chromatography of molecular weight distribution was obtained by HPLC after the purification of sea cucumber peptide with ultra-filtration membrane. The results indicate
7、that the active peptide has a similar molecular weight, which is less than 1600Da. The proportion whose molecular weight is less than 1000Da is 72.07%. The result showed that ultra-filtration can effectively remove the macromolecular protein of the hydrolysis production. The anti-fatigue effects of
8、sea cucumber peptide on mice were studied through different dose. The results show that sea cucumber polypeptide have no obvious effect on body weight in mice, can significantly prolong the time of loaded-swimming and rolling stick, strongly degrade the content of blood urea nitrogen and increase th
9、e content of hepatic glycogen of post exercise mice. The sea cucumber peptide has effective actions of raising exercise tolerance, promoting glycogen reservation and accelerating the metabolism of urea nitrogen and the anti-fatigue action is enhanced by increasing the dosage. Keywords: bioactive pep
10、tide sea cucumber enzymatic hydrolysis molecular weight distribution anti-fatigue 烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权说明学位论文使
11、用授权说明 本人完全了解烟台大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 55版权声明版权声明 任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人，未经本论文作者同意，不得将本论文转借他人，亦不得随意复制、抄录、拍照或以
12、任何方式传播。否则，引起有碍作者著作权之问题，将可能承担法律责任。 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 1第一章 绪论 1.1 引言 蛋白质是生命活动的主要物质基础，一切生命活动无不与蛋白质有关。新陈代谢是生命活动的主要特征，而构成新陈代谢的所有化学变化，都是在酶的催化之下进行的。生长、运动、呼吸、免疫、消化、光合作用等，都必须通过蛋白质来实现。虽然遗传信息的携带者是核酸，但遗传信息的传递和表达不仅是在酶的催化之下，并且也是在核酸和蛋白质的调节之下进行的1。因此，有关蛋白质的研究一直以来都是生物技术领域的研究热点。 蛋白质分子基本上是由20种氨基酸以
13、肽键的方式连接而成的大分子，它不但在食品加工业上具有重要的加工功能特性（例如感官及运动知觉性、水化作用、流变性质、表面活性和纤维组织化、凝聚性等） ，而且在生物学上具有重要的生物学功能，主要表现在以下几个方面2： （1）酶的催化作用：几乎细胞体内的所有生物化学反应都需要酶来催化。在不同的生物体内发现了几千种酶，每种酶催化一种化学反应，所有的生物体都需要依赖酶的活力。 （2）传输和贮存作用：有些蛋白质传输和贮存像金属离子、氧气、葡萄糖和酯类等在生化上非常重要的物质。 （3）运动的结构组织化作用：有些蛋白质使细胞或组织产生收缩，改变形状，很多蛋白质用来增强生物体的强度或起保护作用。 （4）防御功能
14、：很多蛋白质用来抵抗外来物的入侵或者防御损伤。如免疫球蛋白或者抗体能识别、沉淀或者中和入侵的细菌和病毒，使它们能与外来物结合，或者包围外来物使其失活。 （5）调节作用：很多蛋白质能帮助调节细胞活性或者其生理功能，其中很多是激素蛋白。其它的调节蛋白质与DNA键合在一起，调节酶的RNA的生物合成。 肽与蛋白质都是由氨基酸通过肽键连接起来的大分子聚合物。 肽是构成蛋白质的结构与功能片断，是由两个或两个以上氨基酸分子通过肽键相互连接组成的。以氨基酸数量来划分，10 个以下的称为小分子肽或寡肽 （oligopeptide） ， 10个以上的称为多肽 （polypeptide） 。 一般认为，氨基酸数目少
15、于50个称为肽。生物活性肽（Bioactive peptides）是指那些具有特殊生理活性的肽类。其实绝大部分蛋白质都是一些具有不同功能作用的生物活性肽的前体，本身的肽链组成与结构中存在着具有一定功效的氨基酸序列片断（功能区） ，在正常状态下，蛋白质的肽片断没有释放出来，但是一旦通过某种方法，把功能片断单独从蛋白质肽链中功断并释放出来，就能显示出独特的生物活性，这就形成所谓的生物活性肽3。自从1979 年，Brantl.等人4首先报道喂食牛乳酪蛋白酶解物的豚鼠小肠中发现了具有类吗啡活性的短肽以来，人们对蛋白酶解物烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 2
16、开发生物活性肽方面的研究进展迅速，其生理功能越来越受到人们的重视，并日趋成为保健药物以及食品工业领域的研究热点。 1.2生物活性肽的理化特性57 生物活性肽的理化特性主要包括溶解性、稳定性、乳化性、渗透压和流变性能等，在很多方面具有优于蛋白质的特性。 1、溶解性 溶解性是肽最重要的理化性能之一，也就是在大幅度的 pH、温度、离子强度、氮浓度范围内的可溶性。许多学者研究表明：即便是有限的或部分水解作用都会使最终水解物的溶解性增加，特别是在其源蛋白的等电点范围内（pH4-5） 。溶解性的增加可能是由于水解物分子量的下降和水解新产生的可离解的氨基和羧基基团，从而增加了水解物的亲水性之故。这种溶解性的增强可扩大生物活性肽的应用范围。 2、稳定性 蛋白水解物中肽的稳定性是指含水解物的产品的热稳定性、 与其它组分共处时稳定性及贮存稳定性。肽的水溶液具有极佳的耐盐性、热稳定性以及贮存稳定性。如水解度较低条件下（DH=8% ） ，从乳清蛋白的胰蛋白酶水解物
