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1、TSS 方法(又称一步法)制备感受态细菌程序一、 准备工作1、配置 1M 氯化镁或硫酸镁氯化镁(一般含6 个水分子)或硫酸镁(二者效果一样)母液,不用灭菌,用时根据需要取出滤膜过滤除菌,4保存氯化镁用量(g)2.0 4.1 10.2 20.3 体积( ml)10 20 50 100 2、配制 1 TSS 溶液( 20ml)tryptone(1%) 0.2g Yeast extract(0.5%) 0.1g NaCl(1%) 0.2g PEG(MW= 3350-8000) (10%) 2g DMSO ( 5%)1ml MgCl2(20-50mM) 1M MgCl2 400ul-1ml ,或 0.
2、0810.203 g 六水氯化镁加 14ml 水(最好是超纯水)溶于三角瓶或烧杯中,搅拌使溶解,用量筒定容至20ml,用稀盐酸或氢氧化钠调ph 至 6.5(6.4-6.8 均可 ),过滤除菌( 0.22 或 0.45um 滤膜),4保存备用(可保存6 月左右)。注:如配制2 TSS 溶液,试剂加倍即可,其它操作不变。3、准备器具注射器,过滤器及滤膜自来水洗净,去离子水冲洗数次,最后用超纯水浸泡并洗数次,保证器具不含干扰物质,然后装至一干净烧杯(去离子水冲洗过)中高温高压灭菌,注射器可不灭试剂瓶 ,1 个,自来水洗净,去离子水冲洗数次,最后用超纯水浸泡并洗数次,灭菌,用于过滤除菌时接收过滤液50
3、ml 管子 (管底注意圆或尖,4离心时与配备的冷冻离心机转头相配)2个(可多准备几个),自来水洗净,去离子水冲洗数次,用超纯水涮洗一次,然后装2/3 管超纯水高温高压灭菌,用时把水倒掉0 1.5ml 离心管 (新开包装的,保证干净),200 个(用来分装感受态) ,用干净的铝盒装好, 铝盒外用报纸包住,橡皮条扎紧,灭菌,用前20 小时整个置于-20冰箱预冷。镊子 1 个,灭菌干净,锡箔纸包好灭菌,用来夹取1.5ml 离心管。液氮 或预冷到 -70的工业酒精(提前20h 用 500ml 玻璃瓶装好置于-70冰箱中预冷) ,用于后面速冻分装好的感受态细胞不含抗生素的 平板 数个,含抗生素的平板数个
4、250ml 三角瓶 (棉塞或锡箔纸封住)3-4 个,全部自来水洗净,去离子水冲洗数次,一个装 10-30mlLB ,另一个装50ml,灭菌,用来培养细菌灭菌一次性吸头,全部新鲜灭菌,且用前未开过吸头盒盖4离心机(最好能装50ml 离心管),超净工作台,酒精灯等二、制作感受态1、划线平板取-20或 -70保存甘油菌划线于无抗生素平板,不要用4或常温保存菌,过夜培养(12-18h)2、扩大培养和培养指数初期细胞挑单菌落至10-30 m lLB (三角瓶或50ml 管)中过夜培养(12-16h) 。分别按 1:100 比例将过夜培养的菌液(500ul)加入到两个盛有50 ml 新鲜 LB 培养液的三
5、角瓶 (容积 250ml)中,于 37 振荡 (225rpm)培养至 OD600 约为 0.3-0.4(前指数期) (培养时间 2h-2.5h),培养超过这个值也没有关系,只是效率略有下降。注意测 OD 值用 LB 作空白。3、离心沉淀,1 TSS 溶液重悬细胞,分装保存各转移至1 个 50ml 洁净离心管(若有盛不下的培养液可丢弃)中,冰浴15-30 分钟使培养物降至0, 4、 1000g(离心力大些也无妨)离心10min,弃上清,收获细菌。加入离心前菌液体积1/10(这里为5 ml)的 1 TSS 液 (冰预冷 30min)悬浮细胞,冰上继续放置 5-15min ,此时感受态细胞即制成。(
6、继续放冰上6h 之内效力不会降低。 )然后按 100 ul/份分装至预冷的1.5 离心管中,盖紧,此时即可用于转化,其余暂时不用者立即 扔进液氮(盛于保温杯, 没有液氮可用 -70的工业酒精) 中速冻(不用液氮直接放入-70也可以)。装好,标好菌种、制作日期、制作人,70保存,可以保存1 年。 (不用额外添加甘油,多此一举)附: 2 TSS 等体积混合法更简捷,但效果远差于上面的方法冰预冷 2 TSS 等体积混合培养至OD600 约为 0.3-0.4 的菌液(菌液冰上预冷30min) ,轻轻混匀,冰上继续放置10min,即可用于转化,冰上分装为100 ul/份,其余方法一样,储存及转化也相同。
7、三、转化取一管( 100 ul)感受态细菌,置于冰上缓慢融化,加入3-5ul 质粒 DNA (0.01100ng纯质粒,不能超过菌液体积的5%,浓度过高会抑制转化)或全部连接产物,轻轻混匀。冰浴 30min( 5min 即可用, 但要达到最佳需30min,以后增加时间对转化效率也无多大影响) 。 (可选步骤: 42热激 90s,然后冰浴2min,但这种热激处理有没有用尚未知,原文献结果显示热激效率小于不热激的)加入 0.9ml 含 20mmol/L 葡萄糖(单独配置母液0.2M ,灭菌,按1/10 体积加入,提高菌代谢效率,没有也可以)的LB 培养液 (或 TSS 液),37 度 150rpm
8、 温和振荡( 225rpm 快速振荡也可以)培养60min,使表达抗抗生素基因。涂布,室温放置约20min-1h 晾干后放于37 度恒温培养箱过夜培养(17-20h) 。检查转化效率。注:1、试剂必须是分析纯以上纯度,且尽可能新鲜2、制作感受态和转化必须冰上操作,且必须保证避免感染杂菌,因此一些步骤必须 超净工作台酒精灯下操作,移液器和台面必须用酒精擦拭,并且紫外线灭菌,遵守无菌操作规则。3、检测转化效率时用稀释到1-10ng/ul 的纯质粒3-5nl,同时设置阴性对照,即不加DNA ,其余同,涂于相同抗生素平板4、转化效率与DNA 浓度有很大关系,当浓度太浓时转化效率急速下降,所以DNA浓度
9、不宜太浓,最多不要超过1ug,一般 0.1100ng 即可。5、本法适用于多种常用菌的转化,如DH1 、 DH5a 、HB101 、JM109、LE392 、MM294 、RR1 、SCS-1、 XL-1 等。参考文献本文在参考网络程序和原文文献基础上完成,并经过自己多次实验验证原文文献: One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,Vol. 86, pp. 2172-2175, Apri1989