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1、TSS 方法（又称一步法）制备感受态细菌程序一、 准备工作1、配置 1M 氯化镁或硫酸镁氯化镁（一般含6 个水分子）或硫酸镁（二者效果一样）母液，不用灭菌，用时根据需要取出滤膜过滤除菌，4保存氯化镁用量（g）2.0 4.1 10.2 20.3 体积（ ml）10 20 50 100 2、配制 1 TSS 溶液（ 20ml）tryptone(1%) 0.2g Yeast extract(0.5%) 0.1g NaCl(1%) 0.2g PEG(MW= 3350-8000) (10%) 2g DMSO （ 5%）1ml MgCl2(20-50mM) 1M MgCl2 400ul-1ml ，或 0.
2、0810.203 g 六水氯化镁加 14ml 水（最好是超纯水）溶于三角瓶或烧杯中，搅拌使溶解，用量筒定容至20ml，用稀盐酸或氢氧化钠调ph 至 6.5(6.4-6.8 均可 )，过滤除菌（ 0.22 或 0.45um 滤膜），4保存备用（可保存6 月左右）。注：如配制2 TSS 溶液，试剂加倍即可，其它操作不变。3、准备器具注射器，过滤器及滤膜自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，保证器具不含干扰物质，然后装至一干净烧杯（去离子水冲洗过）中高温高压灭菌，注射器可不灭试剂瓶 ，1 个，自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，灭菌，用于过滤除菌时接收过滤液50
3、ml 管子 （管底注意圆或尖，4离心时与配备的冷冻离心机转头相配）2个（可多准备几个），自来水洗净，去离子水冲洗数次，用超纯水涮洗一次，然后装2/3 管超纯水高温高压灭菌，用时把水倒掉0 1.5ml 离心管 （新开包装的，保证干净），200 个（用来分装感受态） ，用干净的铝盒装好， 铝盒外用报纸包住，橡皮条扎紧，灭菌，用前20 小时整个置于-20冰箱预冷。镊子 1 个，灭菌干净，锡箔纸包好灭菌，用来夹取1.5ml 离心管。液氮 或预冷到 -70的工业酒精（提前20h 用 500ml 玻璃瓶装好置于-70冰箱中预冷） ，用于后面速冻分装好的感受态细胞不含抗生素的 平板 数个，含抗生素的平板数个
4、250ml 三角瓶 （棉塞或锡箔纸封住）3-4 个，全部自来水洗净，去离子水冲洗数次，一个装 10-30mlLB ，另一个装50ml，灭菌，用来培养细菌灭菌一次性吸头，全部新鲜灭菌，且用前未开过吸头盒盖4离心机（最好能装50ml 离心管），超净工作台，酒精灯等二、制作感受态1、划线平板取-20或 -70保存甘油菌划线于无抗生素平板，不要用4或常温保存菌，过夜培养（12-18h）2、扩大培养和培养指数初期细胞挑单菌落至10-30 m lLB （三角瓶或50ml 管）中过夜培养（12-16h） 。分别按 1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到两个盛有50 ml 新鲜 LB 培养液的三
5、角瓶 （容积 250ml）中，于 37 振荡 （225rpm）培养至 OD600 约为 0.3-0.4（前指数期） (培养时间 2h-2.5h)，培养超过这个值也没有关系，只是效率略有下降。注意测 OD 值用 LB 作空白。3、离心沉淀，1 TSS 溶液重悬细胞，分装保存各转移至1 个 50ml 洁净离心管（若有盛不下的培养液可丢弃）中，冰浴15-30 分钟使培养物降至0， 4、 1000g（离心力大些也无妨）离心10min，弃上清，收获细菌。加入离心前菌液体积1/10（这里为5 ml）的 1 TSS 液 (冰预冷 30min)悬浮细胞，冰上继续放置 5-15min ，此时感受态细胞即制成。（
6、继续放冰上6h 之内效力不会降低。 ）然后按 100 ul/份分装至预冷的1.5 离心管中，盖紧，此时即可用于转化，其余暂时不用者立即 扔进液氮（盛于保温杯， 没有液氮可用 -70的工业酒精） 中速冻（不用液氮直接放入-70也可以）。装好，标好菌种、制作日期、制作人，70保存，可以保存1 年。 （不用额外添加甘油，多此一举）附： 2 TSS 等体积混合法更简捷，但效果远差于上面的方法冰预冷 2 TSS 等体积混合培养至OD600 约为 0.3-0.4 的菌液（菌液冰上预冷30min） ，轻轻混匀，冰上继续放置10min，即可用于转化，冰上分装为100 ul/份，其余方法一样，储存及转化也相同。
7、三、转化取一管（ 100 ul）感受态细菌，置于冰上缓慢融化，加入3-5ul 质粒 DNA （0.01100ng纯质粒，不能超过菌液体积的5%，浓度过高会抑制转化）或全部连接产物，轻轻混匀。冰浴 30min（ 5min 即可用， 但要达到最佳需30min，以后增加时间对转化效率也无多大影响） 。 （可选步骤： 42热激 90s，然后冰浴2min，但这种热激处理有没有用尚未知，原文献结果显示热激效率小于不热激的）加入 0.9ml 含 20mmol/L 葡萄糖（单独配置母液0.2M ，灭菌，按1/10 体积加入，提高菌代谢效率，没有也可以）的LB 培养液 (或 TSS 液)，37 度 150rpm
8、 温和振荡（ 225rpm 快速振荡也可以）培养60min，使表达抗抗生素基因。涂布，室温放置约20min-1h 晾干后放于37 度恒温培养箱过夜培养（17-20h） 。检查转化效率。注：1、试剂必须是分析纯以上纯度，且尽可能新鲜2、制作感受态和转化必须冰上操作，且必须保证避免感染杂菌，因此一些步骤必须 超净工作台酒精灯下操作，移液器和台面必须用酒精擦拭，并且紫外线灭菌，遵守无菌操作规则。3、检测转化效率时用稀释到1-10ng/ul 的纯质粒3-5nl，同时设置阴性对照，即不加DNA ，其余同，涂于相同抗生素平板4、转化效率与DNA 浓度有很大关系，当浓度太浓时转化效率急速下降，所以DNA浓度
9、不宜太浓，最多不要超过1ug，一般 0.1100ng 即可。5、本法适用于多种常用菌的转化，如DH1 、 DH5a 、HB101 、JM109、LE392 、MM294 、RR1 、SCS-1、 XL-1 等。参考文献本文在参考网络程序和原文文献基础上完成，并经过自己多次实验验证原文文献： One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，Vol. 86, pp. 2172-2175, Apri1989
