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1、IU pAG pU5353 核酶的研究进展核酶的研究进展 摘要：摘要： 80 年代初，由美国科学家年代初，由美国科学家 Cech 和和 Altman 发现了发现了核酶核酶,随着人类基因工程研究的深入，工作者和基础科学研究人随着人类基因工程研究的深入，工作者和基础科学研究人员开始注意到核酶在各方面的应用潜力。员开始注意到核酶在各方面的应用潜力。关键词：关键词： 概念概念 分类分类 剪接机制剪接机制 反义核酸技术反义核酸技术 医学上的医学上的应用应用 应用实例应用实例 技术问题技术问题核酶的概念核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的 RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能
2、。核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一 RNA 分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割 RNA, 有的能够切割 DNA, 有些还具有 RNA 连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。核酶的分类核酶的分类 剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。、作用机制：通过既剪又接的方式除去内含子 。需要鸟苷酸或鸟苷及镁离子参与剪接机制：剪接机制：I 型内含子的结构特点：1、拼接点序列为 5U G32、中部核心结构3、内部引导序列pGpAG pU3U5OH U5pU3pGpAGOH53II4、剪接通过转酯反应进行剪切型核酶：这类
3、核酶催化自身或者异体 RNA 的切割，相当于核酸内切酶。这类 RNA 进行催化反应时只切不接。类型：1) 自体催化剪切型 2) 异体催化剪切型。特点：在 Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生 5-OH 和 2, 3-环磷酸二酯末端。 核酶的应用核酶的应用核酶是在对多种植物病毒卫星 RNA 及类病毒 RNA 的自我剪接研究中 发现的，数量较少，常见于 rRNA 的内含子。核酶的具体作用主要有：1.核苷酸转移作用。 2.水解反应，即磷酸二酯酶作用。3.磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。4.脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。RNA 内切反应，即 RNA 限制性内切酶作用。核
4、酸内切酶可以催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶仅水解 5磷酸二酯键，把磷酸基团留在 3位置上，称为 5-内切酶；而有些仅水解 3-磷酸二酯键，把磷酸基团留在 5位置上，称为 3-内切酶。能专一性地识别并水解双链 DNA 上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶。当外源 DNA 侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源 DNA 在细菌细胞内的表达，而细菌本身的 DNA 由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护。限制性核酸内切酶可被分成三种类型。型和型限制酶水解 DNA需要消耗 ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对 DNA进
5、行化学修饰的活性。型限制酶水解 DNA 不需要 ATP 也不以甲基化或其它方式修饰 DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割 DNA。因此，被广泛用于 DNA 分子克隆和序列测定。III核酶的具体应用实例核酶的具体应用实例(一一) 抗病治疗抗病治疗 随着对核酶的深入研究，已经认识到核酶在遗传病，肿瘤和病毒性疾病上的潜力。比如，对于艾滋病毒 HIV 的转录信息来源于 RNA 而非 DNA，核酶能够在特定位点切断 RNA，使得它失去活性。如果一个能专一识别 HIV 的 RNA 的核酶存在于被病毒感染的细胞内，那么它就能建立抵抗入侵的第一防线。甚至，HIV确实进入到了细胞并进行了复制，RNA
6、也可以在病毒生活史的不同阶段切断 HIV 的 RNA 而不影响自身的 RNA。又如，白血病是造血系统的恶性肿瘤,目前尚缺少有效的治疗方法。核酶的发现，尤其是锤头状核酶，为白血病的基因治疗带来了新的希望。近些年，在国外的一些国家已经在小白鼠体内得到较好的效果。 （二）（二） 反义核酸技术反义核酸技术 反义核酸反义核酸是指能与特定 mRNA 精确互补、特异阻断其翻译的 RNA 或DNA 分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。它包括反义 RNA、反义 DNA 和核酶三大技术。反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和 失控基因的
7、过度表达上发挥着重要作用。随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究。反义核酸目前有三种来源：一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸，这是反义核酸最普遍的应用方式，包括未修饰 AON 和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰 AON二类，其中以 PSAON 应用最广泛；二是更具有实用价值的工人表达载体，包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向持插入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义RNA 分子；三是天然存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。 作用特点作用特点1.高度特异性：反义
8、核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶 RNA 或 DNA，犹如“生物导弹” 。IV2.高生物活性、丰富的信息量；反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体，碱基排列顺序可千变万化，不可穷尽3.高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译。4.最优化的药物设计：反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息，实际上是最合理的药物设计。5.低毒、安全：反义核酸尚未发现其有显著毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性反义核酸技术与化妆品发展反义核酸化妆品是在生物技术药物研究的基础上最新发展起来的，与传统化妆品相比，具有高效、高选择性
9、、安全环保的特点。反义核酸技术在化妆品领域异军突起，代表了化妆品发展的一个重要方向。 反义技术是应用碱基配对的原理，以体内表达某种特定蛋白质的靶基因为基础，人工设计一段与之互补的基因片段封闭该靶基因，直接阻断该蛋白质的产生。针对有害基因，突变基因，非正常基因及其过度表达的基因，科学家设计了反义核酸，使这些基因关闭或者低表达。反义核酸是人工合成的 DNA 片段（简称寡核苷酸），它与待封闭基因的某一区段互补，能够抑制或封闭靶细胞基因的表达。由于它与基因序列（称为正义链）碱基互补，或者说具有某种意义上的“镜象”关系，因此，这类寡核苷酸称为“反义核酸”。人类基因组计划的进展为反义核酸技术的发展奠定了坚
10、实基础。近年来，国际著名的大型制药公司纷纷以各种方式介入反义技术研究，并且有多个反义核酸药物进入三期临床试验，这些都表明反义核酸技术及其产品的发展前景十分广阔。反义核酸技术在药物研究方面的发展日臻成熟，随着基因组学的发展，在其他方面的应用也开始受到关注。包括农业育种、功能基因研究、化妆品等方面都已经有了成功应用的例子。反义技术是继基因克隆和重组技术之后在分子生物学领域中兴起的一门全新的基因工程技术。采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康，已经成为高科技化妆品研究的一个热点。 与疾病的产生原因相同，人体美的外在表现同样离不开基因。基
11、因通过其表达产物蛋白质调节人体各种生理和生化过程，从而产生影响人体美的结果。应用反义核酸技术筛选出表达影响人体美的蛋白质基因，设计一段与之互补的反义片段，将其封闭，从源头上抑制这种蛋白质的产生，借此达到美V容效果。 目前，国外已有多个化妆品产品应用了反义技术，国内进行反义技术化妆品开发的企业还很少。 反义核酸技术系统应用于化妆品开发的特点 设计简单根据碱基互补原理，只要知道某种美损性皮肤问题的靶基因序列，就可设计相应的反义核酸 DNA，进行系列化妆品产品的开发。 特异性高反义核酸通常为 20 个碱基左右的寡核苷酸，它通过多点与靶基因结合，因而具有非常高的特异性。 靶点丰富人类基因组计划研究成果
12、为反义技术提供了丰富的靶点，可以不断开发出新的美容产品。 反义核酸技术化妆品的特点 与传统化妆品相比，反义核酸技术化妆品突破了传统化妆品的界限。安全性反义核酸 DNA 与人皮肤亲和性和同源性高，对人体皮肤不产生毒、副作用。 参与皮肤细胞的生命活动反义核酸化妆品直接参与人体皮肤细胞的生命活动，阻断致病 mRNA 翻译为致病蛋白质的过程，从本质上改善皮肤质量，达到美容目的。促进健康基因生长，达到综合美容效果明确了与美容相关的功能基因后，利用反义技术，对功能基因进行正向或负向调控，使皮肤细胞达到健康平衡的良好生理水平，达到综合美容效果。 （三）核酶在医学上的应用（三）核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎
13、病毒的研究目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及 HDV 作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)核酶1998 年，美国加利福尼亚大学 Wong-Staal 等利用发夹核酶抑制 HIV-基因表达，并在期临床实验中受到良好效果。3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的 mRNA，抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。五、核酶技术面临的问题五、核酶技术面临的问题VI1、核酶催化切割反应的可 逆性问题2、催化效率低，如何提高催化效率3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞4、使核酶在细胞内有调控地高效表达5、增强核酶在细胞内的稳定性6、对宿主的损伤问题有待进一步考察
