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1、微生物学通报 JAN 20, 2011, 38(1): 21 28 Microbiology China 2011 by Institute of Microbiology, CAS 基金项目：国家自然科学基金项目(No. 50744016, 40871223, 40901148, 41003031); 中国博士后科学基金特别资助项目(No. 200902223); 水体污染控制与治理科技重大专项项目(No. 2009ZX07101-009-03); 国家 863 计划项目(No. 2007AA06Z331); 中央高校基本科研业务费专项资金资助(No. WB0911011, WB10140
2、04) * 通讯作者：Tel: 86-21-64252063; : 收稿日期：2010-06-18; 接受日期：2010-11-09 研究报告培养法和免培养法联合检测油藏环境 烃降解菌和产甲烷菌群多样性 李辉1 林匡飞1 牟伯中2* 张卫1 顾继光3 李洋洋4 (1. 华东理工大学资源与环境工程学院 国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室 上海 200237) (2. 华东理工大学应用化学研究所 生物反应器国家重点实验室 上海 200237) (3. 暨南大学生命科学技术学院 广东 广州 510632) (4. 上海化工研究院 上海 200062) 摘 要: 烃降解菌和产甲烷菌是油
3、藏环境微生物生态系统中重要的功能菌群, 采用DGGE和FISH方法分析了不同油藏样品中两类菌群的多样性和产甲烷活性。DGGE 结果表明, 不同水样的 alkB基因多样性相差较大, 而且注水井条带明显多于采油井。FISH 结果表明, 油藏水样中产甲烷菌含量明显高于烃降解菌, 且两者空间分布的位置较近; 说明油藏环境中烃降解菌和产甲烷菌结成一定的相互关系。 富集培养表明, 胜利油田产出液接种物培养 130 d 后, 石油烃降解率达到 50%以上, 产甲烷的最大速率达到 1.57102 mmol/(Ld)。 利用分子生物学方法分析油藏环境功能菌群的多样性, 可以为开展微生物采油技术的应用提供有用信息
4、。 关键词: 油藏, 分子生态, 微生物多样性, DGGE 指纹图谱, FISH 杂交 Culture-dependent and culture-independent characterization of alkane-degrading bacteria and methanogens consortium diversity associated with petroleum reservoir LI Hui1 LIN Kuang-Fei1 MU Bo-Zhong2* ZHANG Wei1 GU Ji-Guang3 LI Yang-Yang4 (1. State Environmen
5、tal Protection Key Laboratory of Environmental Risk Assessment and Control on Chemical Process, School of Resources and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China) (2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Institute of Applied Chemist
6、ry, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China) 22 微生物学通报 2011, Vol.38, No.1 http:/ (3. College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou, Guangdong 510632, China) (4. Shanghai Research Institute of Chemical Industry, Shanghai 200062, China) Abstract: T
7、he alkane-degrading bacterium and methanogenic were the important functional popula-tions in oil reservoirs and their diversities were investigated by FISH and DGGE, respectively. The DGGE profiles showed great difference between the alkB genes in samples. And the major bands de-tected in injection
8、wells were obviously more than them in production wells. The FISH results indicated that the quantity of archaea was much more than bacteria in the samples and they had close spatial dis-tribution in situ. The results indicated that alkane-degrading bacterium and methanogenic populations were divers
9、e in oil reservoirs and formed compact aggregates in situ. The incubation of Shengli oilfield production water degraded more than 50% residual oil during 130 d culture, with the production rate of methane reaching up to 1.57102 mmol/(Ld). Molecular analysis of the functional populations of mi-crobia
10、l community in oilfield will provide the information for better application of microbial enhanced oil recovery. Keywords: Petroleum reservoir, Molecular ecology, Microbial diversity, DGGE, FISH 油藏环境极端的理化因子对其中的微生物构成了独特的筛选条件。经过长期驯化, 许多菌种不仅完全适应了油藏极端环境, 而且相互作用构成了复杂的微生物群落, 形成了特有的微生物资源和基因资源。人们已经运用分子生物学方法和
11、纯培养方法分析了油藏微生物群落结构, 初步了解了油藏微生物的多样性13。 但当前油藏微生物群落研究面临的最大问题是群落功能分析, 即如何识别功能菌群, 如何分析功能菌群和协同菌群的相互关系, 以及如何将微生物群落结构研究与其功能研究相结合。目前, 国际上尚无系统的油藏微生物群落功能认识, 只有一些零星报道, 例如 Grabowski 等人4用 FISH杂交方法研究了加拿大西部油藏水样中的产甲烷共生菌团, 发现其中烃降解菌和产甲烷菌围绕固态烃底物形成一定的相互关系, 推测可能是该油藏环境中两种功能菌群之间主要的生态关系。 烷烃是原油的主要成分, 也是油藏生态系统碳素循环中的主要成分, 烃降解菌是
12、石油烃的最初分解者, 它的代谢产物为其他菌的生长繁殖提供了丰富多样的营养底物, 因此烃降解菌是油藏环境微生物生态系统中重要的功能菌群。目前, 已经分离了很多烃降解菌56, 并且研究了烷烃降解途径及其基因调控机制, 发现烷烃羟化酶系(Alkane hy-droxylase system), 其中烷烃羟化酶是非铁红素的膜整合蛋白7, 负责催化烷烃生物氧化途径的第一步氧化反应, 决定了烷烃降解的动力学性质8。 研究发现, 原油污染环境中许多微生物都携带了与 alkB 相似的基因类型5,910, 说明这一基因可能在烃降解微生物中普遍存在, 因此 alkB 可以用作分子标记研究油藏环境中烷烃降解菌的多样
13、性。 产甲烷菌也是油藏环境中的一类重要功能菌群, 它们能接受末端电子产生甲烷, 解除生物链的末端抑制, 对石油烃的降解意义重大, 尤其在油藏深部厌氧环境中的碳元素循环中起重要作用, 识别产甲烷菌群将会在油藏微生物群落功能研究中发挥重要作用。迄今为止发现的油藏环境产甲烷菌绝大部分都是利用氢产甲烷菌1114, 这些菌自身不能降解石油烃, 必须依靠烃降解菌先将石油烃分解为小李辉等: 培养法和免培养法联合检测油藏环境烃降解菌和产甲烷菌群多样性 23 http:/ 分子有机酸才能加以利用。因此, 油藏环境中石油烃降解产生甲烷的过程需要烃降解菌和产甲烷菌等功能菌群协同配合, 形成一定的互利共生关系, 这种
14、共生关系也是石油烃降解的关键因素。 本文运用 DGGE 指纹图谱法分析了不同油藏环境中的烷烃羟化酶基因片段(alkB)多样性, 试图通过分析功能基因的表达情况说明烃降解功能菌群的生长情况, 推测其环境适应性。同时, 用 FISH 杂交法检测了油藏水样中的烃降解菌和产甲烷菌分布情况, 并考察了富集培养条件下的降解原油产甲烷速率, 从而对油藏环境烃降解菌和产甲烷菌群结构和功能进行了初步探索。 1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 1.1.1 油藏水样: 用无菌瓶在井头管线采集产出液油水混合物, 装满样品后立即密封瓶口以防止污染, 立即送往实验室, 4 C 保存。 水样分别采自 4 个目标区块:
15、(1) 华北油田 816 区块注水井返排水, 水样外观清澈透明, 命名为华北水样(Huabei); (2) 华北油田巴 19 断块油井产出液, 外观浑浊含有石油, 命名为巴水样(Ba); (3) 胜利油田孤 16 区块注水井返排水, 水样黄色浑浊, 命名为孤水样(Gu); (4) 胜利油田 7N11 区块油井产出液, 外观浑浊含油 10%, 命名为 N 水样(N), 采样日期分别为 2007 年 8 月和 9 月。 1.1.2 试剂和仪器: DNA 提取和纯化试剂盒购自V-gene公司; PCR试剂购自Promega公司; 引物和探针由Invitrogen公司合成并标记荧光素; GelRed染色剂购自 Biotium 公司; 其他化学试剂购自上海医药集团化学试剂公司。PCR 扩增仪购自 MJ 公司; DGGE 电泳系统购自 Bio-Rad 公司; 荧光显微镜(BX51T-32P01-FLB3)购自 Olympus 公司。 1.2 样品预处理和DNA提取 样品在无菌条件下 70 C 温浴 30 min, 加 30%的无水乙醇和石油醚/正己烷/吐温(10:10:1, V/V/V)混合液充分摇匀, 静置使油相和水相分层, 抽取下层水样, 取 2 支无菌离心管, 各装 40 mL, 15 000g离心10
