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1、ICS 65.020.30 B44中中 国国 实实 验验 动动 物物 学学 会会 团团 体体 标标 准准T/CALAS x201x实验动物 汉坦病毒普通 RT-PCR 和实时荧 光 RT-PCR 检测方法Laboratory animal - Methods of conventional RT-PCR and real-time RT-PCR for the detection of Hantavirus（征求意见稿）XXXX - XX -发布- XX - XX 实施中国实验动物学会发 布T/CALAS XXXXXXXXX1前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。本标准
2、附录 A 为规范性附录。本标准由中国实验动物学会归口。本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本标准主要起草单位：广东省实验动物监测所。本标准主要起草人： xx，xx。T/CALAS XXXXXXXXX2实验动物 汉坦病毒普通 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了实验动物汉坦病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于实验动物及其产品、 细胞培养物、 实验动物环境和动物源性生物制品中汉坦病毒的检 测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的
3、。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本标准。 CPE 细胞病变效应（cytopathic effect） Ct 值 荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cycle threshold） HV 汉坦病毒（Hantavirus） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline） PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） RNA 核糖核酸（ribonucleic acid） R
4、T-PCR 逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction） 实时荧光RT-PCR 实时荧光逆转录-聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）4检测方法原理用合适的方法提取样本中的总 RNA， 针对汉坦病毒 M 片段基因设计特异的引物序列， 通过 RT-PCR 对模板 RNA 进行扩增， 根据 RT-PCR 检测结果判定该样品中是否含有汉坦病毒， 套式 PCR 引物中的内 引物可用于病毒分型。 实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加入了一条特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个 报告荧光基团和一个淬灭荧光基团
5、。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增 时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失， 荧光信号产生并被检测仪器接受，随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系。 因此， 可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。 根据两种类型病毒设计两条探针序列可用于汉坦病 毒分型检测，5主要设备和材料T/CALAS XXXXXXXXX35.1PCR 仪。5.2实时荧光 PCR 仪。5.3电泳仪。5.4凝胶成像分析系统。5.5高速冷冻离心机。5.6普通离心机。5.7恒温孵育器。5.8漩涡振荡器。5.9组织匀浆器。5.10
6、生物安全柜。5.11PCR 超净工作台。5.12冰箱（-20）。5.13微量移液器（0.12L，110L，10100L，1001000L）。5.14灭菌离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），灭菌吸头（10L，200L，1mL），灭菌 PCR 扩增 反应管（0.2 mL，八连管或 96 孔板）。5.15聚乙烯薄膜袋：90mm150mm 自封袋，使用前紫外灭菌 20min。5.16采样工具：剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。6试剂除特别说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。6.1灭菌 PBS。配制方法见附录 A。6.2无 RNase 去离子水：经 DEPC 处理的去离子水或商品无
7、 RNase 水。见附录 A。6.3RNA 抽提试剂：TRIzol 或其他等效产品。6.4无水乙醇。6.575%乙醇（无 RNase 去离子水配制）。6.6三氯甲烷（氯仿）。6.7异丙醇。6.8RT-PCR 试剂：PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒或其他等效产品。6.9实时荧光 RT-PCR 试剂： One Step PrimerscriptTMRT-PCR Kit （Perfect Realtime） 或其他等效产品。 。T/CALAS XXXXXXXXX46.10DNA 相对分子质量标准：100bp2 000bp。6.1150TAE 电泳缓冲
8、液，配制方法见附录 A。6.12溴化乙锭：10mg/mL，配制方法见附录 A，或其他等效产品。6.131.5%琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A。6.14引物和探针：根据表 1 和表 2 的序列合成引物和探针，引物和探针加无灭菌去离子水配制成 10mol/L 储备液，-20保存。表 1普通 RT-PCR 检测引物引物名称引物名称引物序列引物序列（53）产物大小产物大小（bp）HV 通用外引物P1AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG 464 P2GTACAICCTGTRCCIACCCC型特异性引物-汉滩型P3GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC 383 P4GG
9、ATTAGAACCCCAGCTCGTCTC型特异性引物-汉城型P5GTGGACTCTTCTTCTCATTATT 418 P6TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG注：简并碱基Y：T/C，R：A/G。表 2实时荧光 RT-PCR 扩增引物和探针引物和探针名称引物和探针名称引物和探针序列（引物和探针序列（53）产物大小（产物大小（bp）Forward primerGWGGVCARACAGCWGAYT251Reverse primerTCCWGGTGTAADYTCHTCWGC汉滩型 ProbeFAM-AGCATCATCGTCTATCTTACATCC- BHQ-1汉城型 ProbeJOE- C
10、CATAATTGTCTATCTGACATCA- BHQ-1注 1：简并碱基 W：A/T，V：A/C/G，R：A/G ，Y：T/C ，D：A/T/G，H：A/T/C。注 2：探针也可选用具有与 FAM、JOE 和 BHQ-1 荧光基团相同检测效果的其他合适的荧光报告基团和荧光淬灭基团组合。7检测方法7.1生物安全措施实验操作及处理按照 GB 19489 的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。7.2采样及样本的处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。7.2.1脏器组织剖检，无菌采集动物肺脏和脾脏，剪取待检样品2.0g 于无菌5mL 离心管，加入4mL 灭菌PB
11、S，使T/CALAS XXXXXXXXX5用电动匀浆器充分匀浆12分钟，然后将组织悬液在4，3000r/min 离心10min，取上清液转入另一无 菌5mL 离心管中，编号备用。7.2.2细胞培养物方法一：直接刮取样品接种后出现 CPE 或可疑的细胞培养物于 15mL 离心管中，3000r/min 离心 10min，去上清，加 1mL 灭菌 PBS 重悬细胞，然后将细胞悬液转移到无菌 1.5mL 离心管中，编号备用。 方法二：将样品接种后出现 CPE 或可疑的细胞培养物反复冻融三次，细胞混悬液转移于 15mL 离 心管中，12000r/min 离心 10min，去细胞碎片，上清液转移到无菌 1
12、5mL 离心管中，编号备用。7.2.3实验动物环境7.2.3.1 实验动物饲料、垫料和饮水取适量实验动物饲料和垫料置于聚乙烯薄膜袋中， 加入适量灭菌 PBS （饲料和垫料需全部浸泡于液 体中） 。 密封后浸泡 510min， 充分混匀， 将混悬液转移至 15mL 离心管中，4， 12,000 rpm 离心 10min， 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中，编号备用。取适量实验动物饮水直接转移到无菌 5mL 离心管 中，编号备用。7.2.3.2 实验动物设施设备用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌 15mL 离心管， 加入适量灭菌 PBS，浸泡 510mi
13、n，充分混匀，取出棉拭子， 将离心管于 4，12,000 rpm 离心 10min， 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中，编号备用。7.2.4样本的存放采集或处理的样本在28条件下保存应不超过24h，若需长期保存，须放置-80冰箱，但应避免 反复冻融（冻融不超过3 次）。7.3样本 RNA 提取7.3.1TRIzol 对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。7.3.2取 200L 处理后的样本加 1mL TRIzol 后，充分混匀，室温静置 10min 使其充分裂解。7.3.3按 200L 氯仿/mL TRIzol 加入氯仿，盖紧样品管盖，用手用力振荡摇晃离心 管 15 秒，禁 用
14、漩涡振荡器，以免基因组 RNA 断裂。室温静置 5 min。4 12,000 rpm 离心 15min。7.3.4离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 存在于 水样层当中，水样层的容量大约为所加 TRIzol 容量的 60%。吸取上层水相，至另一离心管中，注意不 要吸取中间界面。7.3.5按 0.5mL 异丙醇/mL TRIzol 加入异丙醇混匀，室温放置 10min。 4 12,000 rpm 离心 10min， 弃上清，RNA 沉淀一般形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。7.3.6按 1mL 75%乙醇/mLTRIzol 加入 75%乙醇，温和振
15、荡离心管，悬浮沉淀。 4 7,500rpm 离心 5min，弃上清，将离心管倒立吸水纸上，尽量使液体流干。7.3.7室温自然风干干燥 510min，注意 RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。T/CALAS XXXXXXXXX67.3.8用 50100L 无 RNase 去离子水溶解 RNA 样品，制备好的 RNA 应尽快进行下一步 PCR 反应， 若暂时不能进行 PCR 反应，应于-80冰箱保存备用。7.4普通 RT-PCR7.4.1第一轮 RT-PCR7.4.1.1 RT-PCR 反应体系第一轮RT-PCR反应体系见表3。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照 和空白
16、对照，其中阳性对照以含有MVM的组织或培养物提取的DNA作为阳性对照模板，其中阴性对照 以不含有MVM DNA样本（可以是正常动物组织或正常培养物）作为阴性对照模板，空白对照即为不加 模版对照（No Template Control，NTC），即在反应中用水来代替模板。表 3每个样品反应体系配制表反应组份反应组份用量用量/L终浓度终浓度2buffer251Enzyme Mix2P1 (10M)2400nMP2(10M)2400nMDNA 模版10无 RNase 去离子水9总体积507.4.1.2 RT-PCR 反应参数RT-PCR反应参数见表4：表 4RT-PCR 反应参数步骤步骤温度温度时间时间循环数循环数逆转录5030min1预变性955min1变性941min35退火551min延伸7245sec延伸7210min1注：可使用其他等效的一步法或两步法RT-PCR检测试剂盒进行，反应体系和反应参数可做相应调整。7.4.2第二轮 RT-PCR取第一
