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1、Western Blotting 检测人检测人 IgG作者作者 兰州大学生命学院 生物学基地班摘要摘要 本实验采用人血清为材料，对此样品进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人 IgG 为第一抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 为第二抗体，在过氧化物酶底物存在的情况下，检测人的 IgG。关键词关键词 Western Blotting 抗体 电泳前言前言 Western Blotting 是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋
2、白质为抗原，与对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异目的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测目的蛋白质的表达水平。正文正文 一、实验试剂，器材和材料的准备一、实验试剂，器材和材料的准备试剂试剂 （1）药品：）药品：丙烯酰胺 N,N甲叉双丙烯酰胺，四甲基乙二胺，过硫酸铵，三羟甲基氨基甲烷（Tris） ，甘氨酸，琼脂，蔗糖，溴酚蓝，十二烷基硫酸钠，甲醇，甘油，巯基乙醇，考马斯亮蓝 R-250标准分子量蛋白，冰乙醇，兔抗人 IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG，脱脂奶粉，HCL，NaCL，过氧化氢，CoCl2.
3、（2）电极缓冲液：甘氨酸 28.2g，SDS1g，Tris6g,加水至1000ml，ph8.3.用时稀释一倍。（3）转移缓冲液：25mmol/lTris,192mmol/l 甘氨酸，20%甲醇，ph8.3（4）TBS 缓冲液：20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl,ph7.5（5）TTBS:取 100mlTBS,加 50ul Tween-20（6）封闭液及抗体稀释液：3%脱脂奶粉-TBS（7）底物溶液：2.5mg 二氨基联苯胺+9mlTBS+1ml0.3%CoCl2+10ulH2O2,临用前配置。（8）30%丙烯酰胺贮备液:29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，
4、加重蒸水至 100ml。（9）浓缩胶缓冲液：0.5ml/l Tris-HCl，ph6.8（10）分离胶缓冲液：3mol/LTris-HCl,ph8.9（11）10%过硫酸铵：临用前配置（12）10%SDS（13）10%TEMED（14）1%琼脂（15）2x 样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，ph6.8,20%甘油，4%SDS，10%巯基乙醇，0.005%溴酚蓝。（16）低分子量标准蛋白：加 200ul 重蒸水溶解，再加 200ul2x 样品缓冲液，沸水浴加热五分钟，离心后取上清液作为标准样品。（17）考马斯亮蓝 R-250 染色液：考马斯亮蓝 R-250 0.25g，50
5、%甲醇 454ml，冰乙酸 46ml，总体积 500ml。（18）脱色液：乙醇 6ml，冰乙酸 2ml，加水至 20ml。（19）保存液：3%乙酸。器材：器材：夹心式电泳槽，转移电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统实验材料：实验材料：人血清，硝酸纤维素薄膜二、实验过程二、实验过程1.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）灌胶前的准备灌胶前的准备：取两块玻璃板洗净晾干，嵌入橡胶带的凹槽中，一块略长一点的玻璃板下沿与橡胶带框底部之间留有 2-3mm 空隙，以便凝胶的一侧与电泳槽电极液相通；另一块短玻璃板的下沿嵌入橡胶框底部，两块玻璃板之间形成一个“空腔” ，然后将嵌有玻璃的橡胶凹槽装入电泳
6、槽之间，用固定螺丝固定，在长玻璃板一侧的底部用 1%琼脂密封。（2）凝胶的配置凝胶的配置分离胶浓缩胶12430%贮备液/ml3.20.53分离胶缓冲液/ml2-浓缩胶缓冲液/ml-1.0重蒸水/ml2.662.3610%SDS/ul8040抽气十五分钟后再加入下列试剂10%TEMED/ml0.080.0410%过硫酸铵/ml0.040.02总体积/ml84.0（3）灌胶：灌胶：将配置的分离胶加入到橡胶框的“玻璃腔”内，待胶液加至距短玻璃板顶端 3cm 处时停止灌胶，然后再胶液表面上小心加入厚约 0.5cm 的水层，以保持分离胶面平整。待凝胶和水之间界面清晰时，说明胶已经聚合。聚合好的分离胶，倾
7、去上层水，插上加样梳，将配置好的浓缩胶液加到分离胶上，直至短玻璃板的顶端。放置 30-60 分钟待其聚合。（4）加样：加样：拔出加样梳，用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。（5）电泳：电泳：调节电压至 150v 电泳。电泳完成后取出胶，切出 2 条点有样品的胶条，一条含人血清样品和分子量标准蛋白，用考马斯蓝 R250 染色液染色，1h 后，换成脱色液脱色，中间换 1-2 次脱色液至蛋白质条带清晰，再换至 3%乙醇中保存；另一仅含人血清样品的胶条用于转印和酶联免疫染色。2.转印蛋白质到硝酸纤维素薄膜上转印蛋白质到硝酸纤维素薄膜上3.膜的酶联免疫染色膜的酶联免疫染色4.对胶和膜上的显色结果照相对胶和膜上
8、的显色结果照相5.实验结果：实验结果：胶：胶：全长a1a2a3a4a5a6a78.28cm 0.77cm 1.49cm 2.40cm 3.20cm 4.29cm 5.44cm 6.19cm膜：膜：全长全长B1B2B37.47cm0.92cm2.23cm4.12cmMr1（KDa）LgMr迁移率（迁移率（cm）标准蛋白标准蛋白 114.41.1580.748标准蛋白标准蛋白 218.41.2650.657标准蛋白标准蛋白 325.01.3980.518标准蛋白标准蛋白 435.01.5440.386标准蛋白标准蛋白 545.01.6530.290标准蛋白标准蛋白 666.21.8210.180标
9、准蛋白标准蛋白 7116.02.0640.093以相对迁移率为横坐标，以相对迁移率为横坐标，LgMr 为纵坐标作图如下：为纵坐标作图如下：迁移率（cm）未知蛋白 10.123未知蛋白 20.298未知蛋白 30.552将未知蛋白迁移率带入上图中得： LgMr1= 1.9269 LgMr2=1.7019 LgMr3=1.3753 Mr1=84.51KDa Mr2=50.34KDa Mr3=23.73KDa所以，重联分子量是 50.34KDa，轻链的分子量是 23.73KDa。未知蛋白的分子量是 84.51KDa3、讨论讨论1.请用自己的标准曲线求出请用自己的标准曲线求出 IgG 重链的分子量。重
10、链的分子量。重链分子量是 50.34KDa，轻链的分子量是 23.73KDa。未知蛋白的分子量是 84.51KDa2.12%的分离胶适合分离多少分子量范围的蛋白质？的分离胶适合分离多少分子量范围的蛋白质？答：10 到 100kDa3.电极缓冲液中甘氨酸的作用电极缓冲液中甘氨酸的作用?电泳开始后，HCL 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。4.不加封闭液会产生什么样的结果？不加封闭液会产生什么样的结果？用封闭液覆盖空白的 NC 膜，防止一抗与膜结合参考文献参考文献【生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验】沈剑敏编沈剑敏编 兰州大学出版社兰州大学出版社
