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1、本药学论文由免费范文网整理提供慢性髓系白血病首发血小板显着增多作者：沈群，周建伟，朱光荣，杨月艳，仇海荣，朱广荣，夏雯，姜鹏君【摘要】 本研究探讨以血小板显着增多首发的慢性髓系白血病(CML)临床、细胞遗传学及分子生物学特征。应用骨髓细胞涂片、骨髓活检观察细胞形态学改变；RT-PCR 检测bcr/abl 融合基因；常规染色体核型分析及 FISH 检测细胞遗传学变化。结果发现：以血小板显着增多为首发表现的 CML 是一组具有独特临床和生物学特点的疾病，骨髓细胞涂片和骨髓活检表明，骨髓增生活跃，以巨核系异常增生为主，血小板大片成堆，可见圆形核小巨核细胞，中等度白细胞增多，经细胞遗传学和分子生物学检
2、测均证实存在有 Ph 染色体和（或）表达 bcr/abl 融合基因，对此类患者应该早期进行积极治疗，甚至进行分子生物学水平的干预；而原发性血小板增多症（ET）患者则不宜过多地使用化疗药物，否则反而诱致白血病的发生。结论：对血小板明显增多的患者应及时进行 Ph 染色体及 bcr/abl 融合基因表达水平的检测，这对于 ET 及 CML 的诊断和鉴别诊断极为重要，以避免误诊、误治。【关键词】 原发性血小板增多症Chronic Myeloid Leukemia Onset with Marked ThrombocythemiaAbstract This study was aimed to inve
3、stigate the clinical，pathological and biological features of a special case of chronic myeloid leukemia (CML) with marked thrombocythemic onset. The morphological changes of cells were analyzed by using bone marrow smear and biopsy; Ph chromosome，a specific marker of CML，was assayed by conventional
4、chromosomal analysis and fluorescence in situ hybridization，bcr/abl fusion gene was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction. The results indicated that CML mimicked essential thrombocythemia (ET) at presentation was relatively rare and might be misdiagnosed as ET，bone marrow smea
5、r and biopsy revealed，marked thrombocytosis and moderate leukocytosis; RT-PCR，FISH and conventional chromosomal analysis demonstrated the existance of Ph chromosome and bcr/abl fusion gene.This special CML could progress into accelerated phase or blast crisis.The megakaryocytes in Ph+ ET were smalle
6、r than normal ones and had typically hypolobulated round nuclei.Patients diagnosed as Ph+ ET might progress into CML and showed a high tendency to myelofibrosis and blastic 本药学论文由免费范文网整理提供transformation. It is concluded that the value of routine cytogenetical and molecular biological analysis in dia
7、gnosis for potential CML cases，which mimicked ET as in this presentation，is very distinctive，and the importance is magnified by the recent availability of imatinib，a specific inhibitor of the bcr/abl tyrosine kinase produced by the Philadelphia chromosome.Every case of “ET” should be tested for the
8、Philadelphia chromosome and bcr/abl transcript.Key words essential thrombocythemia； chronic myeloid leukemia； Ph chromosome； bcr/abl fusion gene原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）和慢性髓系白血病（CML）属于骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorder，MPD)家族，但两者发病时的表现通常不同，自然病程也不同。最新的资料表明，每个拟诊 ET 的病例必须进行 Ph 染色体的分析1。世界
9、卫生组织（WHO）的诊断标准也明确，ET 的诊断必须排除 Ph 染色体及bcr/abl 融合基因阳性2。因为 ET 和 CML 的鉴别诊断非常重要，且对采用 Ph 染色体基因产物靶向治疗的有效性更具指导意义。本研究通过实例探讨以血小板显着增多为主要表现 CML 的细胞遗传学和分子生物学特征，从而提高对 ET 及 CML 的认识，以免误诊、误治。材料和方法病例患者，女，34 岁。因“发现血小板增多 2 月，头昏、乏力 2 天”，于 2005 年 5 月收治入院。患者 2 月前因腰痛、双手指瘙痒在外院就诊。当时血常规检查显示： WBC 12109/L，Hb 82.8 g/L，Plt 2 52410
10、9/L。骨髓检查：巨核细胞 824 个，产血小板巨核细胞 315 个，血小板成堆可见，考虑为“ET”。予羟基脲口服 1.5 月，血小板基本恢复正常。近 2 天来患者自觉乏力、恶心、纳差、腰痛而来我院就诊。入院当天血常规检查：WBC 14.6 109/L，N 86%，L 11%，E 1%，B 2%，Hb 51g/L，Plt 2365109/L。大便隐血(+)。骨髓常规及骨髓活检提示巨核系异常增生，巨核细胞体积较小，多为不分叶圆核型；常规染色体核型分析、FISH 及 RT-PCR 检测发现 Ph 染色体及 bcr/abl 融合基因；多次中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分明显减低；嗜碱性粒细胞比例增
11、高。诊断：慢性髓系白血病、上消化道出血。细胞形态学检测本药学论文由免费范文网整理提供骨髓细胞涂片 常规瑞氏染色后，光镜下计数 250 个有核细胞，分析各阶段细胞形态及比例；全片计数巨核细胞，并分析 100 个巨核细胞形态。同时分析外周血涂片，并进行白细胞分类及血小板形态分析。骨髓活检 以 10%福尔马林固定骨髓活检标本，常规石蜡包埋、切片、伊红染色，光镜下分析骨髓组织细胞分布及构成。细胞遗传学检测常规骨髓细胞染色体核型分析 抽取肝素抗凝的骨髓 5 ml，计数后按（1-2）106/ml 进行直接法制备染色体标本，然后进行 R 显带处理。每例平均分析 20 个细胞，按人类细胞遗传学国际命名体制IS
12、CN(1995)进行核型描述，每例标本的核型至少需经2 人共同鉴定。剩余的细胞悬液储存于-20，供 FISH 检测。骨髓染色体制备 用 0.2%肝素湿润之针筒抽取骨髓，根据细胞计数，将骨髓按（1-2）106/ml，加入 20 ml RPMI 1640 培养液，37恒温箱放置 24 小时； 加入秋水仙碱，终浓度为0.05 g/ml，于 37放置 1 小时； 离心： 200g10 分钟，弃上清液； 低渗：加入预温至 37的 0.075 mol/L KCl 液 8 ml，轻轻打匀，于 37放置 30 分钟； 预固定：加入 1 ml 固定液轻轻打匀，200g10 分钟； 第 1 次固定：离心后弃上清液
13、，加固定液 8 ml，打匀，于室温放置30 分钟； 第 2 次固定： 200g10 分钟，离心后弃上清液，加固定液 8 ml，打匀，于室温放置15 分钟； 第 3 次固定： 200g10分钟，离心后弃上清液，加固定液 8 ml 打匀，室温放置15 分钟； 离心： 200g10 分钟，弃上清，加适量固定液配成细胞悬液，于 4保存； 气干法制片后，10%姬姆萨染色 20 分钟，水洗，干后镜检。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH) 探针制备： 采用BCR/ABL 双色探针，BCR 结合绿色荧光 SpectrumGreen，ABL 结合红色荧光
14、 SpectrumRed，探针购自美国 Vysis 公司； 间期 FISH： 取出储存于-20的染色体标本，换用新鲜的31 甲醇/冰醋酸固定液，气干法滴片；37 2SSC 中 30 分钟老化，70%、85%、100%的乙醇室温下梯度脱水，每梯度 2 分钟；在变性液（70%的甲酰胺/2SSC）中 72变性 3 分钟，70%、85%、100%的冰乙醇（-20）梯度脱水，晾干。按 1 l BCR/ABL 双色探针加4 l 杂交稀释液加入 Eppendorf 管中，瞬时离心混匀.把探针与稀释液的 Eppendorf 管放入 72水浴锅中变性 5 分钟。按每张玻片加 5 l 的反应体系后，将该玻片盖紧，
15、用本药学论文由免费范文网整理提供胶封牢后置 37湿盒中杂交过夜，将杂交后的片子放于 72，0.3% TritonX-100/0.4SSC 中洗涤 2 分钟，继之用 0.1% Triton X100/2SSC 室温洗涤 1 分钟。避光晾干后按每片加 6 l DAPI/Antifade 复染。 荧光显微镜检查：用 OlympusBX60 荧光显微镜，在 DAPI/FITC/Texas Red 滤色镜的激发下观察间期细胞的荧光杂交信号，每例分析200-300 个细胞，不计数重叠细胞。以患者 3 个或 1 个荧光杂交信号的百分率大于每种探针对照组 X3SD 作为克隆性异常的阳性标准。用 Kodak E
16、ktapress PJC800 负片摄片或应用染色体图像及多彩色荧光原位杂交自动分析仪进行图像采集和分析。分子生物学检测RT-PCR RNA 抽提试剂 TRIZOL、Taq 酶、oligodT(36)AGC、引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；M-MLV、dNTPs(Promega 公司)；阳性对照 K562 细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。TRIZOL 一步法提取患者骨髓细胞总 RNA，用紫外分光光度计(Beckman DU650)检测定量之后将 RNA 统一稀释成 1 g/l。RT 反应：取 RNA 2 l (2 g)，oligodT(36)AGC 3 l，ddH2O 9 l 混匀离心，70，4 分钟，放置冰上 3分钟，离心之后冰浴条件下加入 5缓冲液 6 l，dNTPs（5 mmol/L）1 l，M-MLV 0.5 l，d
