生物大分子的分离纯化

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1、生物大分子的分离纯化 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此 不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是 相同的。为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。 常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等） 、离心、 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦 制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。 1 沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便， 成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制

2、备过程，是分离纯化生物大分子， 特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留 在液相，而与杂质得到初步的分离。 此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶 解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的 大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液 的 pH 值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分

3、离纯化。 选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定 pH 值下易变 的杂蛋白。 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其 他方法结合使用。 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用 PEG 聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 1.1 中盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析“ 。除了蛋白质和酶以外， 多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，2040饱和度的硫酸铵可以使许 多病毒沉淀，43饱和度的硫酸铵可以使 DNA 和 rRNA 沉淀，而 tRNA 保留在上清。

4、盐析 法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：成本低，不 需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。对许多生物活物质具有稳定作用。 中盐沉淀蛋白质的基本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的COOH、NH2 和OH 都是亲水基团，这 些基团与极水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1nm100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极基团越多，水化层越厚， 蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因 素有两个：即电荷和水膜。因为中盐的亲水大于蛋白质和酶分子的亲水，所以加入大量中 盐后，夺走了水分子，

5、破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶 体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 21“所示。 中盐的选择常用的中盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优 点： 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于 酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。由 下表可以看到， （NH4）2SO4 在 0时仍有 70.6的溶解度，远远高于其它盐类： 表 21 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100 毫升水） 0 20 80 100 （NH4）2SO4 70.6 75.4 95.3 103

6、 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 分离效果好：有滇取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去 75的杂蛋白，纯度提 高了四倍。 不易引起变，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用 23mol/L 的 （NH4）2SO4 保存可达数年之久。 价格便宜，废液不污染环境。 盐析的操作方法最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用 固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入， 尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成 不应有的

7、蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在 低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密 度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和 溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫 酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这 一困难，有人经过精心测量，确定出 1 升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录 中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。 盐析曲

8、线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的 硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：取已定量测定蛋白质或酶的活与浓度的待分离样品溶液，冷至 05，调至该蛋白 质稳定的 pH 值，分 610 次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚 开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微 混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第 二个级分，如此连续可得到 610 个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应 的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的 pH 缓冲液中，

9、测定其 蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到 盐析曲线。 盐析的影响因素 蛋白质的浓度：中盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大 的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度 过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白 质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。 通常认为比较适中的蛋白质浓度是 2.53.0，相当于 25 mg/mL 30mg/mL 。 pH 值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变 pH 值

10、可改 变蛋白质的带电质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处 溶解度小，因此用中盐沉淀蛋白质时，pH 值常选在该蛋白质的等电点附近。 温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温 度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度 升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随 浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。 但对于某些对温度敏感的酶，要求在 04下操作，以避免活力丧失。 1.2 有机溶剂沉淀法 基本原理有机溶剂对于许多蛋白质（酶） 、

11、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是 较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极与 其介电常数密切相关，极越大，介电常数越大，如 20时水的介电常数为 80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是 24 和 21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小 溶剂的极，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相 互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异电荷库 仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使 用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周

12、围的水化层中夺走了水分 子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。 有机溶剂沉淀法的优点是：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比 较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析 袋脱有机溶剂） 。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活的大分子容 易引起变失活，操作需在低温下进行。 有机溶剂的选择和浓度的计算用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、 甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和 体积可按下

13、式计算：V = V0 (S2 S1) (100 S2)式中：V = 需加入 100浓度有机溶剂靛积V0 = 原溶液体积S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度100 是指加入的有机溶剂浓度为 100，如所加入的有机溶剂的浓度为 95，上式的 (100S2) 项应改为 (95 S2) 。上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。 有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍 原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。 有机溶剂沉淀的影响因素 温度： 多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低

14、而下降。值得 注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高 就会引起变，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度， 操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是 温度越低，得到的蛋白质活越高。 样品浓度：样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度 样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活 的样品易产生稀释变。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高 分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变的危险，但杂蛋白的共

15、 沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用 5mg/mL20mg/mL 的蛋白质初浓度为宜，可以 得到较好的沉淀分离效果。 pH 值：有机溶剂沉淀适宜的 pH 值，要选择在样品稳定的 pH 值范围内，而且尽可 能选择样品溶解度最低的 pH 值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。 离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例， 盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过 5为宜，使用乙醇的量也 以不超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中盐对蛋白质变有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在

16、 低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时 先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH 值和离子强度，使之达到 最佳的分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可 能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影 响样品的生物活。 1.3 选择变沉淀法这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学质等 方面的差异，选择一定吊件使杂蛋白等非目的物变沉淀而得到分离提纯，称为选择变沉淀 法。常用的有热变、选择酸碱变和有机溶剂变等。 热变利用生物大分子对热的稳定不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变沉淀而保 留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生 物大分子的初期分离纯化。 表面活剂和有机溶剂变不同蛋白质