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1、体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加 50L 以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为 1000g/mlGA3；（ 3）浓度为 1 104 spores/mlP. expansum 孢子悬浮液；（4）浓度为 1000g/mlGA3+浓度为 1 104 spores/mlP. expansum 孢子悬浮液。处理后湿纱布覆盖并用 PE 塑料膜密封作保湿处理 。贮藏于常温（20-25）下。分别在 0、12、24、36 和 48小时取样进行测定酶活性。取样时沿伤口用刀小心切下 1g 果实组织，加入 10 mL 冷(4)的 50 mmol/L 磷酸缓冲液（PBS）内含 1
2、.33 mmol/L EDTA 和 1% PVPP 缓冲液(pH 7.8)。研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机 12000rpm 离心 15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取 100mg 牛血清白蛋白，溶于 100mL 蒸馏水中，即为 1 000gmL 的原液。8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50mL90乙醇中，加入 85（WV ）的磷酸 100mL，最后用蒸馏水定容到 1 000mL。8.1.3 乙醇；磷酸（85） 。试验方法：分别取牛血清
3、白蛋白标准溶液（1000gmL）0,、10L、20L、40L 、60L 、80L、100L，无菌水补至 100L，加入考马斯亮蓝 G-250 试剂 5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验 7 中得到）400L 加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。9.1.2 Na2HPO4-12H2O；NaH 2PO4-2H2O。9.1.3 磷酸缓冲液 PBS 配制母液：0.2M Na 2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水；0.2M NaH2PO4：
4、称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于 1000ml 水。按表 2 配制 0.2M 的 PB（mL） ，最后稀释至所要的浓度表 1 不同 pH 值 PBS 的配制pH 0.2M Na2HPO4（mL） 0.2M NaH2PO4（mL）6.4 26.5 73.57.0 62 387.8 91.5 8.59.2 试验仪器9.3.1 200L、1000L 移液枪，eppendorf；9.2.2 酶标仪， ；9.2.3 酶标板，JET BIOFIL9.3 试验方法 9.3.1 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定SOD 采用氮蓝四唑（nitro-blue
5、 tetrazolium，NBT）法（Beauchamp 和Fridovich，1971）6 。反应步骤为：取 200l粗提液，加入 3.7 ml NBT 反应液50mmol/LpH7.8 的磷酸缓冲液（PBS）配制的含 77.12mol/L氮蓝四唑, 100mol/LEDTANa 2和 13.37mmol/L 甲硫氨酸溶液 ，在 30下保温 2 分钟后加入 100l核黄素溶液（pH7.8 的 50mmol/L 磷酸缓冲液中含 80.2mol/L 核黄素和100mol/LEDTANa 2） ，在 4000Lx 日光下反应 20min。然后迅速测定 A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定
6、时按比例调整为总反应体积为 400L。酶活性按以下公式计算：以抑制 NBT 光化还原的 50为一个 SOD 活性单位，结果以 U/mg 蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD 总活性(A ckA E)V/(Ack0.5WVt)式中， Ack为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V 为样品液总体积（ml） ；Vt为测定时样品用量（ml） ；W 为样品鲜重（g）或蛋白质含量（ mg） 。9.3.2 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定CAT 活性参照 Aebi (1984)7的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为 400L 。400 L反应液含 50
7、mmol/L 的 PBS (pH 7.0)，30 mmol/L 的 H2O2和50 L 粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在 240 nm 吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度 25，pH7.0 条件下 1 分钟分解 1mol过氧化氢所需酶量，结果以 U/mg 蛋白或 U/g 鲜重表示。9.3.4 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定PPO 活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaos 和 Mercado-Silva，2004）8 。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为 400L。350L 反应液（用 50
8、mmol/L，pH6.4 的PBS 配制，内含 100mol/L 邻苯二酚）中加入 50 L 的粗酶液，平衡 1 分钟后连续测定398nm 吸光度的变化。以 1 分钟内 398nm 吸光度上升 0.01 为一个酶活性单位，结果以U/mg 蛋白或 U/g 鲜重表示。9.3.5 过氧化物酶（Peroxidase，POD ）活性测定POD 活性测定采用愈创木酚法（Lurie 等，1997)9。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为 400L。反应体系为 30L粗酶液，290 L 0.3%愈创木酚（用 50 mmol/L的 PBS 配制，pH 6.4）和 80L0.3%H2O2（用 50 mmol
9、/L 的 PBS 配制，pH 6.4）。反应在加入 H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在 470 nm 的上升值。酶活性以每分钟上升 0.01为一个单位，结果以 U/mg 蛋白或 U/g 鲜重表示。体系二SA对苹果果实抗性相关酶活性的影响用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。每个伤口处等量（30l）加入（ 1）SA 溶液（ 10g/ml） ；（2）酵母悬浮液（10 8 cells/ml） ；（3）用SA溶液（10g/ml）配制的酵母悬浮液（10 8 cells/ml） ；（4）无菌水（作为对照） 。处理后贮藏于常温（20 C） ，并用PE 塑料膜密封作保湿处理。定期取样对组
10、织酶活性和蛋白质含量进行测定。取样时先用无菌刀片表皮组织，然后用打孔器分别在伤口处和离开伤口组织5mm 位点取样。每个处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次。2.7.3 SA对梨果实POD活性影响完好的果实在SA（100 g/ml）溶液中浸泡10分钟后贮藏于常温（20 C） ，然后定期取样对组织POD 活性进行测定。以无菌水处理的为对照。提取时先用刀片削去表皮组织。每个处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次。2.7.4 酶提取和测定的程序1 克果实组织加入 10 ml 冷(4) 的 50 mmol l-1磷酸缓冲液（PBS）内含 1.33 mmol l-1 EDTA 和 1
11、% PVPP 缓冲液(pH 7.8)。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机 12000rpm 离心 15 分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。2.7.5 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定SOD 采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp 和Fridovich，1971）。反应步骤为：取 200l粗提液，加入 3.7 ml NBT 反应液50mmol/l pH7.8 的磷酸缓冲液（PBS）配制的含 77.12mol/l氮蓝四唑, 100
12、mol/l EDTANa 2和13.37mmol/l 甲硫氨酸溶液 ，在 30下保温 2 分钟后加入 100l核黄素溶液（pH7.8 的50mmol/l 磷酸缓冲液中含 80.2mol/L 核黄素和 100mol/lEDTANa 2） ，在 4000Lx 日光下反应 20min。然后迅速测定 A560。以不照光的管做空白。 （用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为 400l，下同） 。酶活性按以下公式计算：以抑制 NBT 光化还原的 50为一个 SOD 活性单位，结果以 U/mg 蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD 总活性(A ckA E)V/(Ack0.5WVt)式中， Ac
13、k为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度； V 为样品液总体积（ml） ；Vt 为测定时样品用量（ml） ；W 为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg） 。2.7.6 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定CAT 活性参照 Aebi (1984)的方法进行测定。3ml 反应液含 50 mmol/l 的 PBS (pH 7.0)，30 mmol/l 的 H2O2和 50 l 粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在 240 nm 吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度 25，pH7.0 条件下 1 分钟分解 1mol过氧化氢所需酶量，结果以 U/
14、mg 蛋白表示。2.7.7 过氧化物酶（Peroxidase，POD ）活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie 等，1997) 。反应体系为200l粗酶液，2.2 m l 0.3%愈创木酚（用50 mmol/l的PBS 配制，pH 6.4）和 0.6 ml 0.3%H2O2（用50 mmol/l的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H 2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg 蛋白表示。2.7.8 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bol
15、aos和Mercado-Silva ，2004）。2.9ml 反应液（用50mmol/l，pH6.4的PBS 配制，内含100mol/l 邻苯二酚）中加入 100 l的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以 1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。2.7.9 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定PAL 活性测定参照 Camm 和 Towers（1973）的方法进行测定。1ml 粗酶液中加 4ml 硼酸盐缓冲液 (pH 8.8)含 10mmol/L 苯丙氨酸；对照不加粗酶液，另加 1ml 蒸馏
16、水。反应液在恒温水浴 30中保温 0.5h 后，测定 290nm 处吸光度。以每小时在 290nm 处吸光度变化0.01 所为一单位，结果以 U/mg 蛋白表示。2.7.10 脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定LOX活性参照 Todd等 (1990)的方法进行测定。反应体系为 2.8ml反应液（用40 ml浓度为 0.1mol/l PBS内含 200 l的 Tween 20和40 l的亚油酸，pH 7.0）中加入200l的粗酶液。平衡1分钟后连续测定234nm吸光度的变化。以 1分钟内234nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。体系三（柑橘）1 酶提取和测定的程序（SOD 、 POD、 PPO、 LOX）0.300 g 果实组
