《细胞实验技术新1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞实验技术新1（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一、名词解释紫外-可见分光光度法及其用途:是利用物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法。电泳及其主要类型：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。荧光及其用途: 细胞中的某些物质(如叶绿素)经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。萨瑟恩杂交Southern blotting： 是是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探
2、针互补的特殊核苷序列诺森杂交Northern hybridization等几种杂交技术及其用途： northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验物是RNA，而不是DNA。首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然后用含有变性剂(硫氰酸胍、乙二醛)的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。细胞培养：把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。沉
3、降速度法等离心技术：沉降速度法:根据被分离物质的沉降系数不同来分离物质。梯度中最大的密度要小于样品中最小颗粒密度。包括差速离心法和区带离心法(速度-区带离心法)。盐析及分段盐析等蛋白质分离技术：是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉淀时所需的 pH 值与离子强度也不相同，改变盐的浓度与溶液的 pH 值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开，这种分离蛋白质的方法称为分段盐析法(fractional saltingout)。摩尔吸光系数：物质对某波长的光的吸收能力的量度。指一定波长时，溶液的浓度为
4、1 mol/L，光程为 1cm 时的吸光度值，用 或 EM 表示。 越大，表明该溶液吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。预杂交及其作用：预杂交(Prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。细胞系(cell line):原代培养细胞成功传代即为细胞系。细胞株(cell strain):从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）：利用流式细胞仪对
5、处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速(每秒可达 1000-10000 个)的定量分析和分选(纯度可达 99%以上)的技术。二、问答题1.什么是柯勒照明？简述柯勒照明的方法与步骤。柯柯勒照明：光源经集光器将视场光阑像呈到标本平面上，灯丝成像于孔径光阑。柯勒照明五步走：1将目镜屈光度调节环放置零位 。2用10X物镜将标本调焦清晰 。3把灯丝成像于聚光镜孔径光阑的下表面上。4收小视场光阑。 5通过聚光镜调节旋钮将视场光阑调清晰，使用对中旋钮将视场光阑对中。 6放大视场光阑至外切于视野位置 7取下目镜，检查物镜的后焦面处光是否均匀。缩小孔径光阑，直到其出现在物镜后焦面上。调整孔径光阑，使它的直
6、径为物镜后焦面直径的78。放回目镜，检查成像质量。8为了得到合适的对比度及景深，需要调节孔径光阑。8在更换过物镜以后，需要调整视场光阑(控制照明区域)，以及孔径光阑2. 试述一般光学显微镜的基本构造。系统构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置目镜(放大物象) 镜筒( 连接目镜与物镜)转换器(调换物镜) 粗准焦螺旋(升降镜筒)细准焦螺旋(升降镜筒)镜臂( 连接)镜柱 (支持)物镜(放大物象 )载物台(放置玻片)通光孔(光线通过) 压片夹(固定玻片)反光镜(反射光线)3. 电子显微镜与光学显微镜主要的区别：照明源不同。电镜所用的照明源是电子枪发出的电子流，而光镜的照明源是可见光(日光或灯光)，由
7、于电子流的波长远短于光波波长，故电镜的放大及分辨率显著地高于光镜。透镜不同。电镜中起放大作用的物镜是电磁透镜(能在中央部位产生磁场的环形电磁线圈)，而光镜的物镜则是玻璃磨制而成的光学透镜。电镜中的电磁透镜共有三组，分别与光镜中聚光镜、物镜和目镜的功能相当。成像原理不同。在电镜中，作用于被检样品的电子束经电磁透镜放大后打到荧光屏上成像或作用于感光胶片成像。而光镜中样品的物像以亮度差呈现。所用标本制备方式不同。电镜观察所用组织细胞标本为超薄切片。而光镜观察的标本为一般载玻片上，如普通组织切片标本、细胞涂片标本、组织压片标本和细胞滴片标本等。 4. 如何在石蜡切片中显示细胞中的糖类、蛋白质、核酸等物
8、质？糖类：固定石蜡切片脱蜡过碘酸酒精液中氧化水洗Schiff试剂染色亚硫酸水洗苏木精染色自来水分色脱水透明封片观察。结果：动物细胞中的糖元呈紫色颗粒状。DNA：卡诺固定液石蜡切片复水Schiff染色亚硫酸水洗1%亮绿复染脱水二甲苯透明封片观察,结果：DNA呈紫红色，细胞质呈绿色。蛋白：取材固定(4冷丙酮冰箱中)石蜡切片脱蜡复水蛋白作用液(pH=5) 1-2hr.水洗2%醋酸水洗 1%硫化铵水洗脱水透明封片 观察。结果：依其在细胞中的含量多少呈现黄棕色至棕黑色不等。5. 冰冻蚀刻技术制备电子显微镜标本的基本过程。标本置于干冰或液氮中冰冻升温至-100 切割升温断面喷涂铂-碳膜铂-碳膜(复型膜)
9、铜网 观察。优点：不经固定、脱水、包埋，有利于保持天然特征。尤其适于显示各类膜结构。分辨力强，反差好。图像立体感强。样品可长期保存缺点：易产生冰晶，技术难度大。6.试述 CO2临界点干燥法的基本原理及简单流程。就是利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。利用液态 CO2 与气态交换出现临界点状态时表面张力为零的现象(31.1, 72.9 大气压)，保持临界温度，缓慢排气，当 CO2 气体排完时，样品即干燥。流程：样品整理(3-5mm) 2-3%戊二醛固定 1-2 hr.(或 与 1-3%四氧化锇(锇酸)双固定 1-2 hr.) 磷酸
10、缓冲液或超声清洗丙酮梯度脱水100%乙酸戊酯 2 次各 10-20min 高压容器中加液态 CO2 进行临界干燥。7.试比较沉降速度法和沉降平衡法，各有何特点？各有哪些类型？分别用于哪些物质的分离？沉降速度法:根据被分离物质的沉降系数不同来分离物质。梯度中最大的密度要小于样品中最小颗粒密度。包括差速离心法和区带离心法。沉降平衡法:根据被分离物质的密度不同来分离物质。梯度中最大的密度要大于样品中最大颗粒密度。包括：差速离心，速度区带(或速度梯度)离心，沉降平衡离心。8.如何利用联苯胺反应对样品中的过氧化酶进行定位？原理：细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色或者棕色络合物，根据蓝色或者棕色的出现
11、位置来显示细胞内过氧化物酶的存在。(1) 把洋葱根尖徒手切成 20-40m 的薄片，再用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块； (2)把上面两个材料浸在含有 0.1钼酸铵的 0.85盐水溶液 10ml 中 5min(钼酸铵的作用是催化剂)； (3)浸在 10ml 联苯胺溶液内 5min 以上，直到切片出现蓝色； (4)用 0.85%盐水 10ml 清洗 3 次，每次 5min； (5)将样品置于载波片上展开，盖上盖玻片，显微镜观察9. 如何利用间接免疫荧光技术显示胞质微管？ 用对应于细胞内的微管蛋白抗原的特异抗体，与体外培养细胞一起温育，使抗体与微管特异地结合。然后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记在抗
12、球蛋白抗体上，温育样品，使两种抗体结合，使微管间接地标记上荧光素。在荧光显微镜下即可看到胞质内的微管网络。细胞培养PBS漂洗-20甲醇固定冷丙酮提脂第一抗体温育PBS 第二抗体温育PBS-甘油封片观察结果：荧光显微镜下，蓝光激发，微管网络呈亮黄色。10. 常用的蛋白质分离技术有哪些？1根据溶解度不同的分离纯化方法：盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀2根据分子大小不同的分离纯化方法：透析、超滤、凝胶层析、离心3据电离性质不同的分离纯化方法：电泳、离子交换层析4根据配体不同的分离纯化方法：亲和层析11. 简述植物细胞培养的主要类型及特点外植体培养:诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；
13、进行无性繁殖；制取代谢产物。悬浮细胞培养:适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。原生质体培养:培养脱壁后的细胞，特点:比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。单倍体培养:通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。12. 光学显微镜按光学原理和所用光源可分为哪些主要类型？各有何特点和功能？适用于何种研究工作？普通光学显微镜特点：物体的光线通过物镜后在目镜焦点(f)稍内方形成一个倒立的放大实像(BA)。一般的低倍物的观察荧光显微镜特点及功能：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式是利用一定波长的光激发
14、标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像用途：用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。激光共聚焦扫描显微镜特点：用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。借助计算机分析和模拟，能显示细胞样品的立体结构。 用途：用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 暗视野显微镜特点：采用特殊的中央有挡光片的聚光镜，斜射照明。视野背景是黑的，被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的 用途：适用于观察活细胞的结构与细胞内微粒的运动相差显微镜特点：把透过标本的可见光的光程(波长)差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度
15、，使各种结构变得清晰可见。 用途：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有 PH 的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜 。偏光显微镜特点：光源前有偏振片(起偏器)，进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器 (与起偏器方向垂直的偏振片)。载物台可以旋转。用途：用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。微分干涉差显微镜特点：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。倒置显微镜特点：物镜与照明系统颠倒；物镜工作距离较长。用途：用于观察容器培养的活细胞，三、论述与实验设计题1. 设计
16、一个研究方案利用光学显微镜观察细胞中的骨架系统即微管系统。2.试述聚丙烯酰胺凝胶电泳体系组成及其三种效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳体系组成：1不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。2浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC13分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。4电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。5.2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。三种效应：1)样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应: 由于分子筛表面积的95位于孔径内需要通过筛选来甄别邻近分子的大小只有小分子才能通过晶体的孔径
