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1、由代谢网络分析发现菌种代谢工程改造新策略 袁倩倩 李斐然 罗浩 马红武 赵学明 天津大学化工学院 天津大学教育部系统生物工程重点实验室 中国科学院天津工业生物技术研究所中国科学院系统微生物技术重点实验室 摘 要： 微生物菌种需要经过一系列代谢工程改造才能实现高产特定产品, 而经过二十多年的研究积累, 应用传统代谢工程方法通过局部途径分析发现菌种改造策略遇到严重瓶颈, 急需从新的角度进行分析以发现新的改造策略。本文结合本实验室已有工作以及文献报道的实例, 阐述了应用代谢网络模型分析发现产品合成新途径进而指导代谢工程菌种改造方面的研究进展。本文总结了代谢网络模型的构建方法及应用代谢网络模型进行途径
2、预测的常用方法, 将已有的模型指导代谢途径改造的策略总结为两类, 即模型指导的产品从无到有和从有到优的改造策略, 并结合实例分别对这两类策略进行详细阐述。同时本文阐述了目前利用代谢网络模型进行途经预测中存在的问题, 并且针对这些问题提出了一些可行的解决方案。关键词： 代谢; 生物工程; 模型; 优化设计; 作者简介：袁倩倩 (1988) , 女, 博士研究生, 研究方向为代谢网络模型指导的代谢工程菌种改造。E-mail:。作者简介：李斐然 (1993) , 女, 硕士研究生, 研究方向为基因组尺度代谢网络模型构建及分析。E-mail:lifeiran_。作者简介：马红武, 研究员, 主要研究方
3、向为代谢网络模型指导的代谢工程改造。E-mail:ma_。基金：国家重点基础研究发展计划 (2012CB725203) Discovery of new strain modification strategies by metabolic network analysisYUAN Qianqian LI Feiran LUO Hao MA Hongwu ZHAO Xueming School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University; Key Laboratory of Systems Microbial Biote
4、chnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; Abstract： A series of metabolic engineering modifications are needed for high efficient microbial production of bioproducts.After about 20 years of extensive studies, the traditional metabolic engineering methods d
5、epending on intuitive analysis of local pathways are facing big challenges in discovery of new engineering strategies and new methods from different aspects are required.In this paper, the recent research progresses, on using computational analysis of large scale metabolic networks for the design of
6、 new pathways to new products or improved production yield, was reviewed; and how a microbial strain could be modified to enable and strengthen the new pathways for efficient production of biochemicals.The methods of reconstructing metabolic network model and commonly used methods for metabolic netw
7、ork prediction for discovering new strategies were elaborated.Metabolic pathways designed by metabolic networks were categorized into two groups, namely guiding the strain to produce a certain product from scratch or from low to high yield.In this paper, examples of combining these two types of stra
8、tegies were presented.The various problems encountered in the computational design of new metabolic pathways were discussued, and feasible solutions to address those problems were proposed to enable reliable pathway design.Keyword： metabolism; biological engineering; model; optimal design; 1991 年 BA
9、ILEY1在“Science”发表文章, 首次提出代谢工程这一概念。代谢工程利用多基因重组技术对细胞代谢途径进行有目的的改造, 从而改善细胞的代谢特性, 实现高效生产特定目标产物2。然而由于技术的局限性, 传统代谢工程一般只对产品合成相关的局部代谢网络进行分析改造, 如对产品合成途径相关基因进行过表达、对竞争途径进行敲除以及解除产物抑制等。但是经过二十多年的研究积累, 目前仅通过局部代谢网络设计, 或者仅通过经验分析得到的改造策略大部分都已有人研究过, 有效的操作靶点也已经被专利保护, 还有一大部分改造策略未达到预期效果, 因此需要从新的角度出发寻找新的改造策略。随着基因组测序技术的快速发展,
10、 完成全基因组测序的生物越来越多, 而由基因组构建细胞全局规模的代谢网络模型正成为一种对细胞生理特性进行分析的有力工具。基于基因组规模代谢网络模型 (genome-scale metabolic networks, GEMs) , 通过理性途径设计方法从更大网络角度寻找新的代谢工程改造策略越来越受到重视。这也正是合成生物学的核心思想, 即从理性设计角度设计新的生物学系统以及对已有的生物系统进行重设计从而使其为人类所服务。基因组尺度代谢网络模型只需要基于反应计量关系和质量平衡方程就可以建模, 不需要调控信息以及酶动力学信息等复杂数据, 因此比较容易获得。目前已有上百个代谢网络模型被发表, 可以在
11、 GSMNDB、Bi GG 和 Met Rxn 数据库中查找已有模型信息。其中 GSMNDB 由天津大学3开发, 该数据库收录了 89 个菌株 135 个模型。Bi GG 由 PALSSON 课题组4开发, 该数据库不仅包含模型信息, 还可以可视化显示代谢途径。Met Rxn 数据库5不仅提供模型信息, 同时对模型中反应进行处理, 保证模型中代谢物电荷守恒。KIM 等6对目前为止已发表的 GEMs 及其上述数据库进行了综述。利用基因组尺度代谢模型可以从系统水平指导代谢工程进行理性的途径设计, 如基因敲除靶点设计7、基因过表达靶点设计8、新途径预测9等。本文将重点介绍基因组尺度代谢网络模型在指导
12、代谢工程新途径设计方面的研究进展。1 代谢网络模型概述1.1 已有代谢网络模型及模型构建方法1999 年, EDWARDS 等10构建了第一个基因组尺度代谢网络模型 (GEM) , 目的菌株为流感嗜血杆菌。随后代谢工程常用模式菌株大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等的 GEMs 被陆续构建出来。2000 年 EDWARDS 等构建了第一个大肠杆菌 GEM 模型 i JE66011, 2003 年第一个酿酒酵母模型 i FF708 被构建出来12,2007 年第一个枯草芽孢杆菌模型被构建13。目前已有 5 个大肠杆菌模型以及 10 个酿酒酵母模型被陆续发表出来并被广泛应用于指导代谢工程菌种改造。表
13、 1 列举了应用这两株工程菌株代谢网络模型成功指导不同产品高产菌株代谢工程改造的案例, 其中涉及的模型预测方法在下文阐述。表 1 大肠杆菌和酿酒酵母基因组尺度代谢网络模型应用于指导代谢工程菌株改造文章总结 下载原表 基因组尺度代谢网络模型的构建是一个循环反复添加反应以及修正错误的复杂过程, 缺乏统一的模型构建规范, 使模型的质量良莠不齐。2010 年, PALSSON等32在“Nature Protocols”发表了一篇指导 GEMs 构建的指南。该指南把模型构建分解成 96 个具体步骤, 并对每个步骤进行详细讲解, 是目前指导谢网络模型构建最全面的指南。模型构建主要包括 3 步:模型的初步构
14、建, 即根据基因组注释数据添加基因-酶-反应信息;模型精炼, 即添加交换反应、运输反应、分室信息、确定生长维持能需求以及菌体组成方程;模型修正, 即对模型中错误, 包括方程是否配平、可逆性是否正确、是否存在缺口等进行查找和修正。随着基因组测序技术的快速发展, 人们通过手工构建代谢网络模型的速度远远赶不上测序基因组发表的数目。为了解决此问题, HENRY 等33构建了一站式完成模型构建、优化以及分析的在线平台 Model SEED, 该平台可以高通量的产生、优化和分析基因组尺度代谢网络模型。只要提供目的物种的基因组序列数据, Model SEED 就可以在 48h 之内完成基因组注释以及模型构建
15、的工作。2013 年, AGREN 等34开发了集模型构建、分析及可视化于一体的本地化工具箱 RAVEN, 可以自动化填补模型缺口进行质量控制, 可以对模拟结果进行可视化显示, 并且可以对模拟结果进行分析。2015 年, DIAS 等35开发了一个基于 Java 平台的用户友好的模型构建平台 Merlin, 与其他自动化构建工具相比, Merlin 能够更加准确地注释编码转运蛋白的基因, 并且可以预测出蛋白的分室信息, 并为其添加相应的基因-酶-反应信息。3 个工具的详细信息列于表 2。1.2 途径设计方法通量平衡分析 (flux balance analysis, 简称 FBA) 36利用线
16、性规划来求解拟稳态条件下的通量分布, 是对代谢网络模型进行定量分析以及预测最优途径的常用算法, 也是很多其他模型预测算法的基础。基于 FBA 的通量可变性分析 (flux variability analysis, FVA) 方法37可以预测代谢途径中每个反应的通量变化范围。SEGR 等38开发了最小化代谢调整 (minimization of metabolic adjustment, MOMA) 算法。MOMA 假设代谢网络在受到扰动时能够进行自我调整维持生存, 算法的核心思想是保证扰动后状态下的通量分布与野生菌株的通量分布改变最小, 一般用来评估敲除靶点后对生长和产物合成的影响。为了预测针对目标产品的基因敲除策略, MARANAS 等39在 FBA 基础上开发了基因敲除算法 Opt Knock。该算法通过求解双层线性规划问题来预测某一产物生成的基因策略
