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1、1溶血磷脂酸上调 THP1细胞基质金属蛋白酶9 的表达及活性【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶 9(MMP9)在溶血磷脂酶(LPA)致动脉粥样硬化中的作用及机制。方法 以不同浓度LPA(010 mol/L）刺激人单核细胞株 THP1 细胞 4 h， RTPCR 法测定 MMP9 mRNA 表达，酶谱法检测 MMP9活性，Western 印迹法检测核蛋白 NFB p65 表达变化。结果 随着 LPA 剂量的增加，MMP9 表达及活性，核蛋白 NFB p65 表达逐渐增强，在 LPA 1 mol/L 时达到最高点，然后逐渐减弱，LPA 以剂量依赖的方式激活 NFB，在转录水平促进 THP1 细胞M
2、MP9 mRNA 表达，增强 MMP9 活性。结论 LPA 可能通过激活 NFB，在转录水平促进 THP1 细胞 MMP9 mRNA 表达，并增强其活性，促进粥样硬化发生和发展。 【关键词】 溶血磷脂酸；THP1 细胞；基质金属蛋白酶9溶血磷脂酸（LPA)是一种结构简单，具有激素和生长因子样的磷脂信使。近年来研究发现，LPA 具有促进动脉硬化和血栓形成的作用，因此引起极大重视1 。从血小板活化、内皮细胞功能障碍、诱导与维持血管壁炎症反应，到增加斑块的不稳定性、导致斑块破裂、局部栓子形成， 进而导致脑卒中或心肌梗死等缺血事件的2发生等无不与 LPA 密切相关。MMP9 ，又称明胶酶 B，是 MM
3、P家族中的一个重要成员，对血管壁的基底膜和细胞外成分具有清除作用，使纤维帽崩溃影响斑块的稳定性。MMP9 不仅能促进动脉粥样硬化(AS)的发展2 ，并且是 AS 斑块不稳定的主要因素3 。单核巨噬细胞是参与粥样硬化的主要炎性细胞。有研究表明，LPA能活化单核细胞和 T 淋巴细胞，促进其表达和分泌 MMPs，而后者的表达和活化是 LPA 导致斑块不稳定或破裂的主要因素之一4 。本研究应用 LPA 刺激体外培养的人单核细胞株 (THP1)，观察LPA 对 MMP9 表达及活性变化以及核因子 NFB 表达变化，进一步探讨 LPA 在致动脉粥样硬化中的作用及机制。1 材料与方法1.1 材料Trizol
4、 Reagent 为 Invitrogen 产品；Taq DNA 聚合酶及缓冲系统、dNTP Mix 为 Fermentas 产品，DNA Marker 和RNasin 购自 TaKaRa，ReverTra AceTM First Strand cDNA Synthesls KIT 为 TOYOBO 产品，THP1 为人单核细胞株，购自BIOCHAIN 公司，181 LPA 购自 SigmaAldrich 公司，MMP 酶谱分析试剂盒（MMP2 、MMP9) 购自普利莱基因技术有限公司，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天)。31.2 细胞培养及干预试验THP1 细胞培养于含 10小牛血清
5、的 RPMI1640 培养液中，37，5 CO2 下生长。THP1 为悬浮型生长，23 d 换液，细胞生长至(46)106ml 时及时传代。将 THP1 细胞无血清培养过夜，以 106/孔接种于 24 孔培养板，分别以 LPA 0、0.1、0.5、1、5、 10 mol/L 处理 4 h 后收集细胞，以RTPCR 法检测 MMP9 mRNA 水平。酶谱法检测 MMP9 活性。提取细胞核蛋白以 Western 印迹法检测 NFB p65 水平。1.3 总 RNA 提取用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA，按照说明书进行。将 1 l(浓度按照 1 gl 计)总 RNA 反转录后行 PCR。PC
6、R 扩增体系25 l，其中含 2PCR master 混合液 12.5 l，上、下游引物各0.75 l，cDNA 模板( 逆转录产物)1 l，以 Biometra PCR 仪( 美国，UNO II 型) 作热循环：预变性 94 3 min；循环：94 45 s、54 45 s、7245 s、共 30 循环。循环结束后 7210 min。MMP9 引物及内参 GAPDH 引物由 Invitrogen 公司合成，引物序列如下：MMP9 上游：5 TCCCTGGAGACCTGAGAAC3，下游：43TTGATGAGCCTTCTGAACGG5，扩增片断长度为 306 bp；GAPDH 上游：5ACCA
7、CAGTCCATGCCATCAC3，下游：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，扩增片段长度 450 bp。取PCR 产物各 5 l 在 1.0琼脂糖凝胶中电泳(120 V 恒压电泳 45 min)，应用 GelDoc 2000 型全自动凝胶成像分析仪 (BoiRad 公司，美国)照相并测定每条带的光密度值，以 GAPDH 表达量为内对照计算并比较各组样本 MMP9 的相对表达量。1.4 MMP9 活性检测采用酶谱法检测。按照蛋白抽提试剂盒操作说明抽提细胞总蛋白。取 5 l 阳性混合物与试剂 1(2 X SDSPAGE nonreducing buffer，普利莱基因技术有限公司，P
8、1700)混合等体积混合，待测样品 5 l 按照 11 稀释与试剂 l 混合后直接上样每孔 10 l，不加热变性，以 30 mA 恒流电泳，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。小心去除压缩胶层，放入干净瓶皿中以适量蒸馏水冲洗凝胶。以加入试剂 4(10 ml 1buffer A)，室温漂洗凝胶 215 min。中间换液23 次。倒掉 Buffer A，加入试剂 5(10 ml 1buffer B)，室温孵育 4 h。凝胶加入 SDSPAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液。于扫描仪上扫描凝胶，显示调整为灰度，并分析 IOD 值。92 kD 为MMP9， 130 kD、225 kD 为 proMMP9） 。
9、以对照组(LPA 0 mol/L)条带的光密度为 1。同一条带上其余的与之对比，用此相对5值反映酶活性的大小。1.5 蛋白印迹分析收集细胞，按照核蛋白抽提试剂盒操作说明(碧云天公司)抽提细胞核蛋白，蛋白浓度由 BCA 法检测。取 50 g 蛋白样品与上样缓冲液变性行 SDSPAGE 电泳，电泳条件为 200 V。电泳完毕后进行转膜，将电转膜置于 5的脱脂奶粉中封闭， 4 过夜，以PBST 漂洗膜 23 次，于加样槽中加入 NFB p65 抗体约 1 ml(NFB p65 1300，GAPDH 110 000)，注意保证膜的所有部分同溶液接触，室温下于摇床孵育，PBST 洗涤 10 min，加入
10、过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(11 000)，每个加样槽中加入二抗 1 ml 左右室温下于摇床孵育 1 h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。PBST 洗涤后进行 ECL 底物化学发光，暗室曝光 530 s，照相。阳性条带以 Gel pr04.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其 IOD值，以 GAPDH 的表达量为内对照计算并比较各组样本的相对表达量。1.6 统计学处理每组实验重复 3 次，数据以 xs 表示。各组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，所有统计分析均用 SPSS 16.0 软6件进行。2 结 果2.1 LPA 上调 THP1 细胞 MMP9 mRNA 表达LPA
11、 0、0.1、0.5 、1、5 、10 mol/L 刺激 THP1 细胞 4 h后，THP1 MMP9 mRNA 分别为0.0570.004，0.0850.005，0.1060.007，0.1400.005，0.1180.003，0.1050.005，各组间差异有统计学意义(P0.05)。LPA 以剂量依赖的方式诱导 THP1 细胞 MMP9 mRNA 表达水平增高，在 LPA 1 mol/L 时表达水平最高，与其余各组相比，差异显著（P0.01） ，见图 1。2.2 LPA 对 THP1 细胞 MMP9 活性的影响不同浓度 LPA 刺激 THP1 细胞 4 h 后，THP1 细胞MMP9 活
12、性与基础水平对照组(LPA，1 mol/L)相比，以剂量依赖的方式增加。LPA 0.1、0.5、1.5 、10 mol/L 时，MMP9 活性分别为对照组(1.160.35)、(1.370.03)、(1.630.04) 、(1.380.02)、(1.290.01)倍(P0.05） ， LPA 1 mol/L 时活性最强，与其余各组相比，差异有显著性（P0.01)，与 MMP9 mRNA 表达水平一致。72.3 LPA 诱导 THP1 细胞 NFB p65 活化Western 印迹结果显示，不同浓度 LPA 刺激 THP1 细胞 4 h 后，在 LPA 以剂量依赖方式激活 NFB p65，核蛋白
13、 NFB p65 表达水平增加，在 1 mol/L 活性最强(LPA 0、0.1、0.5、1、5、 10 mol/L 时，THP1 细胞核蛋白 NFB p65 吸光度比值分别为0.250.01，0.310.01，0.430.01 ，0.580.02,0.450.02,0.440.02，组间差异有显著性(P0.05)。3 讨 论MMP9 可由中性粒细胞，单核巨噬细胞，血管内皮细胞等多种细胞合成并以无活性酶原形式分泌，通过纤溶酶等水解而活化，其作用底物包括明胶、V 型明胶原、弹性蛋白等。病理情况下潜在型 MMP9 被激活，表达上调，主要通过血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖、凋亡57及细胞外基质的重塑8
14、 。MMP9 主要通过粥样斑块基底膜和纤维帽的重要成分 V 型胶原的降解、中膜平滑肌细跑向内膜迁移，加速 AS 进程并导致不稳定斑块的形成8 。MMP9 过度表达在血管重构中起到重要作用，通过降解细胞外基质，增大管径、内膜面积及细胞核密度，为斑块的生长提供空问，8当这种过程达到极点，无法阻止时，可导致斑块破裂。我们在此前的研究中发现，颈部存在不稳定斑块的脑梗死患者血清 MMP9 浓度显著增高9 ，并且 MMP9 在不稳定冠状动脉粥样斑块的表达显著高于稳定斑块组10 ，表明 MMP9 是形成不稳定性斑块的一个重要促进因素。LPA 积聚在粥样斑块内膜处，并且在斑块脂质核心处含量最高11 。大鼠粥样
15、硬化斑块模型中，LPA 和 MMP9 水平均显著升高，二者呈正相关12 。本研究发现，LPA 以剂量依赖的方式上调 THP1 细胞 MMP9 mRNA 表达，并相应促进其活性增加。同时激活 NFB p65，促使核蛋白 NFB p65 表达水平增加。MMP9 的调节主要通过基因转录、酶原激活及 MMP 生理性抑制物(TIMP1)3 个水平实现，其转录水平的调节可能通过转录因子活化蛋白 I(Ap1)和核转录因子 NFB 途径实现。NFB 为一组转录调节因子，通常以二聚体形式与其抑制蛋白 B 结合存在于细胞浆中。当细胞受到各种刺激(包括细胞因子、缺氧、病毒、细菌感染等)后， B 磷酸化，从而使 NFB 活化，由胞浆转移到细胞核内，与基因操纵子的 NFB 特异性位点结合，启动基因转录。因此，LPA 可能通过激活 NFB，在转录水平促进THP1 细胞 MMP9 mRNA 表达，并增强其活性，促进 AS 发生发展以及不稳定斑块的形成，从而促使血管事件的发生。针对 LPA9增强 MMP9 活性的机制和意义进一步深入研究对于防治 AS，稳定斑块，减少血管事件的发生有可能提供新的方向和线索。【参考文献】1 Xu YJ，Aziz OA，Bhu
