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1、1奥扎格雷钠对缺血再灌注大鼠脑海马区细胞保护作用的研究作者：马瑛 靳学婷方艳秋谭岩【摘要 】 目的 观察奥扎格雷钠对大鼠脑缺血/ 再灌注后 IL6 和TNF 蛋白表达的影响，探讨奥扎格雷钠对缺血再灌注大鼠脑海马区细胞的保护作用及其作用机制。方法 将 40 只 SD 雄性大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注组、生理盐水对照组和奥扎格雷钠治疗组。采用大鼠大脑中动脉线栓(MCAO) 法制备局灶性脑缺血/ 再灌注模型，应用免疫组化技术分别检测各组大鼠脑组织 IL6 和TNF 蛋白表达情况。结果 与假手术组相比较，脑缺血/再灌注组IL6 和 TNF 蛋白的表达明显增多(P0.05)，奥扎格雷钠能够明显减少
2、 TNF 的表达(P0.05)。结论 奥扎格雷钠对大鼠脑缺血/ 再灌注具有保护作用，其机制可能与抑制 TNF 表达有关。 【关键词】 奥扎格雷钠; 脑缺血/再灌注;白细胞介素 6;肿瘤坏死因子 【Abstract】 Objective To observe the effect of ozagrel sodium on the levels of IL2 and TNF in rats with cerebral 2ischemiareperfusion injury， and study the mechanisms of protective effect s of Ozagrel sod
3、ium against focal cerebral ischemiareperfusion injury in rats. Methods The rats were randomly divided into sham， ischemiareperfusion， saline and ozagrel sodium groups. The right middle cerebral artery of the rats were occluded by inserting a thread through internal carotid artery for 2 h， and then r
4、eperfused for 12 h. Immunohistochemical techniques were used to detect IL6 and TNF protein expression in the brain tissue of rats. Results The levels of IL6 and TNF were significantly increased in the brain tissue of ischemiareperfusion group compared with those of sham group. Compared with that of
5、ischemiareperfusion group， ozagrel sodium significantly reduced the level of TNF(P 0.05). Conclusions Ozagrel sodium can reduce ischemiareperfusion injury by decreasing the damage to the TNF.【Key words】 Ozagrel sodium;Ischemiareperfusion;IL6;TNF奥扎格雷钠(Ozagrel sodium) 是目前广泛应用于临床治疗脑3血管病(CVD)的药物之一1 ，但其具
6、体作用机制报道很少。 IL6和 TNF 在脑组织损伤和修复过程中起着重要的作用，奥扎格雷钠是否通过影响 IL6 和 TNF 的表达实现作用，尚未见到实验研究报道。本实验观察奥扎格雷钠对缺血再灌注大鼠脑海马区细胞的保护作用，并对其作用机制进行探讨，为其治疗脑血管病提供更深层次理论依据。1 材料与方法1.1 动物 健康成年 SD 雄性大鼠 40 只，购自天津中医药大学实验动物养殖中心，体重 300350 g。将 SD 大鼠随机分成假手术对照组、缺血/再灌注组、奥扎格雷钠治疗组、生理盐水对照组，每组 10 只，其中奥扎格雷钠治疗组在再灌注前 30 min 舌静脉注射奥扎格雷钠 8 mg/kg，生理盐
7、水对照组注射等量生理盐水。1.2 缺血/ 再灌注大鼠模型的制备2 采用大鼠大脑中动脉线栓(MCAO)法：用 6%水合氯醛 ( 0.40.5 ml/100 g)腹膜腔内注射麻醉，颈部正中切口，暴露颈总动脉在其深面穿一细线，钝性分离颈内、外动脉。在颈外动脉上剪一小口，用制备的插线 (在插线20 mm 处做一标记) 插入颈外动脉至颈总动脉，将颈外动脉拉向下方，使其与颈内动脉成直线，将插线经颈总动脉分叉处插入颈内动脉。插线入颅后，一方面注意插入长度，另一方面应注意手感，当4遇到阻力时应立即停止，以免用力过大插破血管。然后收紧颈外动脉根部线的活结，松开颈总动脉夹，观察有无出血，抽出颈总动脉深面的细线。连
8、续缝合手术切口，注意动物保暖，待其清醒后观察其行为和症状。栓塞 2 h 后进行再灌注，再灌注时间为 12 h。假手术组仅分离双侧颈总动脉，但不阻断血流。1.3 海马区脑组织检测 应用 HE 染色观察组织坏死情况，应用免疫组织化学方法检测组织 IL6 和 TNF 蛋白含量变化。光学显微镜下，采用 BI2000 医学图像分析系统对免疫组织化学切片结果进行观测，对于 IL6 免疫阳性细胞和 TNF 免疫阳性细胞的形态学观测时以 100 倍光镜下所见形态为准;免疫阳性细胞数量的统计，采用 400 倍光镜下每张切片选取 5 个最高密度区，对免疫阳性细胞的数目进行计数。1.4 统计学分析 采用 SPSS1
9、0.0 进行统计学分析，在进行多组间比较时采用 q 检验，两组比较时用 t 检验。2 结 果2.1 海马区 HE 染色结果 假手术组海马区神经胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，核仁清晰，胞浆无红染。海马区锥体细胞排列整齐，高倍镜下可见锥体细胞核大而圆、核仁明显;缺血/5再灌注组及生理盐水对照组海马区神经胶质水肿加重，海马锥体细胞排列散乱，胶质细胞稀疏变性，海马区锥体细胞出现异常变化，细胞体积缩小，核不规则，大量变性，变性的锥体细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红;奥扎格雷钠治疗组海马区锥体细胞层结构基本正常，但神经元周围间隙扩大、胶质轻度水肿，可见血管周围炎性细胞浸润(图 1)。图 1 各组海马区
10、HE 染色结果(400)图 2 各组海马区 IL6 免疫组化结果(100)2.2 海马区IL6 和 TNF 免疫组织化学观测结果 假手术组海马区 IL6 免疫阳性细胞有少量表达，主要分布于皮质内，而髓质内少见或未见。缺血/再灌注组 IL6 免疫阳性细胞表达数量明显增多，在脑组织缺血损伤和坏死区呈密集分布，向周围逐渐减少，髓质表达相对增多,与假手术组差异性显著(P0.05)(见表 1，图 2)。同时检测到假手术组大鼠海马区 TNF 免疫阳性细胞有少量表达，而缺血/再灌注组大鼠海马区 TNF 免疫阳性细胞表达数明显增多，与假手术组之间有显著性差异(P0.05)。经过奥扎格雷钠治疗后表达迅速降低，逐
11、渐趋于正常(P0.05)(见表1，图 3)。表 1 各组大鼠海马区 IL6 和 TNF 免疫组化阳性细胞百分率与假手术组比较：1)P0.05;与缺血/ 再灌注组比较：2)P0.053 讨 论6奥扎格雷钠是一种选择性的血栓烷 A2(TXA2)合成酶抑制剂，广泛应用于临床对脑血管疾病的治疗。本实验显示，奥扎格雷钠能够明显减轻缺血脑组织的损伤程度，其保护作用机制可能与其对IL6 和 TNF 表达的调节有关。TNF 作为细胞因子网络中的重要成员，在脑组织缺血性损伤的发生、发展过程中起着重要的作用。在中枢神经系统内，TNF 主要来源于小胶质细胞、星性胶质细胞、神经元细胞、血管内皮细胞和侵入的白细胞，但正
12、常状态下表达较低3 。脑缺血/ 再灌注后，上述细胞分泌 TNF 的表达明显增加，导致脑组织的缺血性损伤，且 TNF 的表达与脑组织的损伤程度呈正相关，通过研究发现，对脑缺血动物模型预先给予 TNF 抗体，可显著降低脑缺血/再灌注损伤，本试验中缺血/再灌注组 TNF 变化与上述相符，给与奥扎格雷钠治疗后 TNF 表达明显下降，说明奥扎格雷钠在脑组织缺血/再灌注中能够抑制 TNF 的表达，减轻对脑组织的损伤4，5 。在本实验中，奥扎格雷钠治疗前后，海马区 IL6 的含量无明显变化，说明奥扎格雷钠对脑组织的保护不是通过调节 IL6 起作用的。在脑缺血/再灌注过程中，TNF 除作为炎性因子直接诱发脑组
13、织的缺血性损伤坏死外，还可作为 IL6 的刺激因素引起 IL67的合成分泌增加;而 IL6 除促进神经生长因子的分泌和对抗兴奋性氨基酸的神经毒性等作用外，还可抑制 TNF 分泌，减弱组织的炎性反应，参与脑组织的缺血性损伤后的神经保护和修复68 。IL6 水平在脑缺血 /再灌注过程的高表达，可能与中性粒细胞和巨噬细胞的浸润有关，而 IL6 水平的持续性升高可能与星形胶质细胞大量分泌 IL6 有关9，10 。综上所述，奥扎格雷钠在脑组织缺血/再灌注过程中的保护作用是通过直接抑制 TNF 对脑组织的损伤作用，间接增加 IL6 对神经系统的保护作用来实现的。【参考文献】1 赵 晴,于挺敏,方 乐，等.
14、 奥扎格雷钠对大鼠急性全脑缺血再灌注损伤后 Bcl2 表达及抑制细胞凋亡的研究J. 中国老年学杂志，2003;23(7):4578.2 张冬梅,刘举祥，陈红兵，等.NFB 和 IL6 在局灶脑缺血/ 再灌注损伤大鼠脑组织中的表达J.中国老年学杂志，2005;25(11):13646.3 Siren AL,Liu Y,Feuerstein G，et al.Increased release of tumor necrosis factoralpha into the cerebrospinal fluid and 8peripheral circulation of aged ratsJ.Str
15、oke，1993;24(6):8806.4 Czermak BJ，Sarma V，Bless NM,el al.In vitro and in vivo dependency of chemokine generation on C5a and TNFalphaJ.Immnunology ，1999;162(4) ：23212315.5 Barone FC，Arvin B，White RF,el al.Tumor necrosis factoralpha.A mediator of focal ischemic brain injuryJ.Stroke，1997;28(6):123344.6 Gravante G，Ong SL，Metcalfe MS,et al.Cytokine response to ischemia/reperfusion injury in an vivo perfused porcine liver modelJ. Transplant Proc，2009;41(4):110712.7 Xuan YT，Guo Y，Han H,et al.An
