注意事项1. 以下的Protocol主要适用于(1)所使用的DNA1反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPsi匀是Fermentas公司的；而在qPC畔，所使 用的Supermix是Bio-RAD公司的2. RT-qPC伸的注意事项：(1) MgC2 的浓度 2~4mM(2) 模板的浓度50ng~5pg之间；(3) 引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在0.1~1uM之间选择；(4) 退火温度的选择，首次设置比实际小5C的，之后在1~2C选择；(5) 引物设计的时候Tm值最好在60C附近，正反向引物的Tm的差值在1~2C之间；(6) 抽提得到的RNA需要验证RNA勺纯度，最好验证一下RNA的完整性；(7) 在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%(主要是模板的加入量会影响反应体系中的 MgC2浓度)；(8) 扩增曲线一定要做通常如果有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度另外就是，一块板子上，尽可能 取尽量多的样本，而不是基因；(9) 扩增效率在90~110%勺范围内是可以接受的；(10) 内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因3. 有关引物设计(1) 扩增子长度小于150bp;(2) 引物Tm的理想值57~60C；(3) 3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个；(4) GC含量介于20~80%理想值40~60%(5) 避免引物二聚体及白身二级结构；(6) 避免引物内的白身重复序列；4. 在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线，做标准曲线的方法，以反转录得到的 cDN硒模板，用qPCR勺引 物做PCFW到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为 基底，以10为倍数，稀释7~8个梯度(稀释点越多，稀释倍数越 大，数据越精确)，做qPCR然后得到标准曲线。
利用标准曲线可 以验证下列因素：(1) 扩增效率； 扩增效率E=10-1/斜率-1(2) 标准品的梯度范围；(3) PC咐制剂的存在于影响；(4) PCR仪验证灵敏度注：如果使用反转录的试剂盒， 那么从反转录开始则会有试剂盒 的使用说明书，之后的步骤都按照说明书来！RNA抽提1. 收集OE直等于0.2的硫化叶菌（ACVY,清洗细胞！2. 加入1ml的TRIzol ,使用移液枪打匀几次！3. 室温下，孵育5min;4. 加入200ul的氯仿（每ml的TRIzol ）用手剧烈震荡15s,室温 孵育 2~3min;5. V2,000g , 4C离心 15min;6. 小心移取无色相到新的离心管中！7. RN瓶淀：加入0.5ml的异丙醇（每1ml的TRIzol）室温下孵育10min; V2,000g , 4 C离心15min （通常情况下，离心之前 RNA是可见的）8. 洗：移去上清，加入1ml的75啷乙醇（每1ml的TRIzol）,轻轻 涡旋混匀，寸500g, 4C离心5min;9. 稍微的风干RNA（不用风干的太狠），使用50ul的RNA-free Water 溶解RNA用移液枪混匀几次，55~60C孵育10min,测得浓度， 部分溶解的RNA勺A260/A280值＜1.6.10. -80 C保存或者是直接使用！除去RNA中的DNA1. DNAE处理RNA<50ug10>buffer3uLDNase I1-5U（根据RNA勺量和DNA勺实用说明）RNA-freewaterUp to 30uL37 C条件下孵育60min2. 加入1诉l的50mM] EDTA之后65C孵育10min,主要是用于除 去 DNA1.3. 将用DNAB处理之后的RNA故PCR佥证，使用荧光定量的引物做 PCR主要是用于验证RNA中的DNAf没有除尽！ 反转录第一条cDNA勺合成：RNA-free WaterUp to 12.5uLTotal RNA (DNasel treated)10ng-5ugReverse Primer终浓度100pmol （可适量增大）轻轻混匀，65 C孵育5min,之后放置在冰上5min;依照下列顺序加入下列物质:5*RT buffer4RNase inhibitor0.5dNTP mix (10uM)2Reverse Transcriptase1轻轻混匀，并且简单离心，主要是让反应均匀;42 C孵育60min,之后70C反应10minRT-qPCR& 应反应体系组成：组成体积/每个反应（ul ）终浓度Sso EvaGreen supermix51*Premier mixVariable300~500nM（常用 500）RNA-free WaterVariableDNA templateVariable （＜10咻系）Total volume10Roche LightCycler LC480 Real-Time PCR systemCycling StepTemperatureTimeCyclesEnzyme activation9530s1Denaturation955s30~40Annealing/extention55~6020s。