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1、测定高粱的加工程度和淀粉 可利用率的改进酶法1IMPROVED ENZYMATIC METHOD TO MEASURE PROCESSING EFFECTS AND STARCH AVAILABILITY IN SORGHUM GRAIN1 熊易强2，S.J.Bartle3，R.L.Preston3摘 要 建立了一种测定蒸汽压片高粱(SFSG，steam-flaked sorghum grain之缩写)的加工程度和淀粉可利用率的改进酶法。为了确定适宜的酶浓度、显色剂、沉淀剂、样品粒度、摇动次数及缓冲液pH，分别做了单项试验。测定了若干样品在不同反应时间(0至48h)所释放的葡萄糖量。 试样有：
2、未熟化高粱(UNC,uncooked之缩写)，全熟化(100%糊化)高粱(CK，cooked之缩写)，UNC与CK各50%的混合物(C50)，还有SFSG。UNC、CK和SFSG的葡萄糖释放过程以一元回归方程表示，其速率常数K与r2分别为0.119与0.98，1.781与0.98，0.368与0.99。C50含有两个淀粉组分，组分1具有快速率常数2.624/h，组分2具有慢速率常数0.066/h(R20.99)。将CK与UNC以不同比例混合制成不同糊化程度的样品，这些样品的葡萄糖释放量与淀粉糊化程度高度相关(r20.99)。调节磨辊间压紧度得到五种不同容重的SFSG样品，容重在476283g/
3、l范围，相应的辊磨电负荷在2151.5A范围内，酶法测定其葡萄糖释放量分别为422、512、588、618、678mg/g，与样品容重的相关性比双折射测定法更大。用这个改进的酶法测定淀粉可利用率更为简便、快速、灵敏，故予以推荐。 前 言 蒸汽压片是提高高粱饲喂肉牛的可利用率的最常用措施。用来衡量加工程度1原发表于J.Anim Sci.1990.68:38613870 2中国北京农业大学访问学者 3美国德州理工大学动物科学系 242 的指标一直是容重、双折射减幅和淀粉的酶敏感度。容重测定具有简易、快速、省钱的优点，被生产上用作质量控制手段。但是，一定容重的样品其加工程度会因籽粒大小、水份、温度、
4、蒸汽调制时间长短和磨辊磨损情况的不同而异(Karr,1984)。双折射分析法直接测定淀粉糊化程度，被用作蒸汽压片高粱(SFSG)加工中定期检测的指标。不过，双折射减幅这一指标可能并不灵敏(Rooney and Pflugfelder,1986)。SFSG的容重通常在283373g/l范围，以双折射法测定的淀粉糊化度在5060%范围内(Karr,1984)。 有几种酶法一直被用来测定加工谷物的淀粉可利用率，但是都比较费时费钱(AFMA，1976)，或者未曾与加工程度进行过定量的相关分析(Liang等人，1970；Osman等人，1970；Herrera-Saldana and Huber,198
5、9)。 本项研究的目标是建立一个可供蒸汽压片加工作为常规质量控制的简易而灵敏的方法。 材料和方法 此法是用脱支酶(amyloglucosidase)将0.2g样品水解，然后用光度计测定葡萄糖与铜试剂或氰化铁的反应产物。详细操作列于附录。为建立这个方法做了五个试验；为验证这个方法做了三个试验。 试验1 测定加工后粮谷的淀粉可利用率所用的酶有：-淀粉酶、-淀粉酶、脱支酶、牛和猪的胰酶制剂(Liang等人，1970；Osman，1970；AACC，1971；AFMA，1976；Herrera-Saldana and Huber，1989)。本法选用脱支酶是因为其最终反应产物只有葡萄糖，从葡萄糖量可以
6、计算出相当的淀粉量(MacRae and Armstrong,1968;Rooney and Pflugfelder,1986)；还有一个好处是脱支酶价格低廉。为确定适当的酶浓度，分别用2、4、6、8、10、14、18、22、26mg脱支酶*与200mg充分熟化的高粱样品(推测是100%糊化)一起反应1h，测定被葡萄糖还原的显色试剂的吸光率。 预先试验过用氰化铁和铜试剂作为测定还原糖的比色剂(Kingsley and Reinhold,1949；Henry,1964)。分光光度扫描显示氰化铁的吸收峰在420nm，而氧化铜还原磷钼酸的产物(“钼兰”)的吸收峰在810nm。最后确定两个方法都选用*
7、No.A-7255,12100单位/g，Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO. 243 420nm，因为810nm过于灵敏，只能允许用很少量样品，因而影响样品的代表性。常规血液葡萄糖分析也一直采用420nm(Henry,1964)。在420nm和本法所用的葡萄糖浓度范围内(最终溶液的葡萄糖浓度是03.6mg/100ml，相当于0875mg/g样品)，两种方法的吸光度均遵循Beer法则。为了对两种比色剂进行比较，用了六种加工程度不同的高粱样品，分别用两种方法测定葡萄糖释放量，并对两种方法都作了方差分析(GLM；SAS，1985)加以比较。方差分析模型构成包括方法、样品、方
8、法样品。这项试验和其他同样安排的试验都用试验机误的均方差得出标准误。凡将处理间样品的方差作为机误项的试验均应得出同样的统计结论。 试验2 为选择蛋白沉淀剂，用了四种加工程度不同的高粱样品对三种蛋白沉淀剂，即钨酸(AFMA，1976)、硫酸锌(Henry，1964)、硫酸镉(Kingsley and Reinhold，1949)作了比较，测定了过滤物特性和葡萄糖释放量。为了比较葡萄糖量，做了方差分析(GLM；SAS，1985)，模型包括沉淀剂、样品、沉淀剂样品。 试验3 为考察样品粒度对葡萄糖生成量的影响，将高粱样品磨碎到通过孔径2mm筛层，此为粗磨(CG)。将粗磨样品第二次磨碎到通过1mm筛层
9、，此为细磨(FG)。对CG和FG样品都测定了葡萄糖释放量，做了方差分析(GLM；SAS，1985)，计算了CV值，以考察粒度的影响。 模型包括粒度与样品，将粒度样品的互作项作为机误。 试验4 为考察反应当中摇动次数对葡萄糖量的影响，用两种SFSG样品做了三种摇动次数的比较，即反应开始时摇动一次；在1小时反应时间中每30分钟摇动一次，共摇三次；每15分钟摇动一次，共摇五次。分别测定葡萄糖量。 试验5 为考察在脱支酶反应期间缓冲液pH的轻微变化是否会影响葡萄糖量，加入乙酸或乙酸钠将缓冲液pH调整到4.45、4.50、4.55，分别测定这三种缓冲液和两种SFSG样品的葡萄糖释放量(GLM；SAS，1
10、985)。 试验6 为研究葡萄糖释放的动力学，制备了四种高粱样品：1)未熟化磨碎高梁(UNC)； 244 2)全熟化高粱(CK)，是将0.2g UNC置25ml试管中加入15ml缓冲液(参见附录)，沸水浴熟化1h，事先进行的试验表明煮沸时间超过30min即不再增加葡萄糖释放量，故熟化1h应视为充分熟化或100%糊化； 3)5050的UNC 与CK混合料(C50)； 4)磨碎的SFSG。 将以上四种样品水解不同时间：0、0.25、0.5、1、 2、 4、 8、 12、 24、 48h，测定其葡萄糖量，导入以下一元和二元方程式(NLIN；SAS，1985)：YA(1-e-kt)；YA1(1- e-
11、k1t)A2(1- e-k2t)。 试验7 为研究葡萄糖释放量与糊化程度的关系，用UNC和CK以适当比例混合配制成两套糊化程度不同的样品：一套有六个样品，糊化程度分别为0、20、40、60、80、100%；另一套有五个样品，糊化程度分别为0、25、50、75、100%。将这两套样品分别水解0.5和1h，测定其葡萄糖量。用葡萄糖数值与糊化程度做回归分析(REG；SAS，1985)。 试验8 为考察本测定法的精确度和灵敏度，通过调整磨辊间压紧度制作了五个容重不同的样品，其容重分别为：476、412、347、309、283g/l。蒸汽调制时间40min,温度96。取样时预先将磨辊温热，在不到1小时之
12、内完成取样。制备样品时用安培计记录了辊磨负荷。将这些样品用本测定法做平行试验测定葡萄糖释放量和糊化程度。对葡萄糖数据做了方差分析(GLM；SAS，1985)，计算了试验内和试验间的CV值。模型包括：容重、试验、容重试验。同时还在一个商业性实验室用双折射法(Snyder,1984)测定了样品糊化程度。酶法和双折射法都分别做了容重与测定值之间的回归分析(REG；SAS，1985)。 结果与讨论 试验1 被还原的氰化铁和铜试剂的吸收曲线(图1)都表明，0.2g全熟化高粱样品经1h水解获得最大葡萄糖释放量所需的最低酶用量是10mg(或120单位)粗制脱支酶。据此将分析操作的酶用量定为15mg。 245
13、 吸收率 酶用量，mg 图1 脱支酶用量与用铜试剂或氰化铁比色剂测定的吸收率 （葡萄糖量）之间的关系（试验1） 表1列出用铜法或氰化铁法测试六种高粱样品所得的相应葡萄糖释放量。氰化铁法所得葡萄糖值总比铜法高一些(P0.01)。其原因可能在于氰化铁的还原势较高，使一些非葡萄糖成分(如戊糖、葡糖醛酸)与氰化铁发生反应(Hiller等人，1925；Henry,1964)。故将铜试剂定为首选。当以糊化程度(如试验7)而不是以葡萄糖绝对值表示时，只要生成非葡萄糖还原性化合物的速率与葡萄糖释放速率相等，两种方法所得结果应当是一致的。用熟化高粱或非熟化高粱作试验样品考察葡萄糖释放量的差别都是可行的。氰化铁法
14、具有试剂单一的优点，因此将氰化铁列为可替用试剂。 246 表 氰化铁法与铜法所得葡萄糖量的比较（试验） 方 法 高粱样品 氰化铁 铜试剂 差 值 葡萄糖mg/g样品 832 785 47 536 471 64 418 393 24 386 365 21 378 358 20 593 480 113平均a523 475 48 a氰化铁法与铜法差异显著(P0.01),SE=10.1 试验2 用钨酸沉淀较慢，且过滤后滤液仍然混浊，说明沉淀不完全。用硫酸锌和硫酸镉都能立即沉淀，且滤液清沏，二者所得葡萄糖量没有差别(P0.2，表2)。结论是硫酸锌或硫酸镉都可作为本测定法的沉淀剂。 表2使用不同沉淀剂的葡
15、萄糖释放量（试验） 蛋白沉淀剂 高粱样品 ZnSO4CdSO4差 值 葡萄糖mg/g样品 276 276 0 612 588 24 304 292 12 639 638 1 158 1635 6 271 2754 7 271 286 15 8 294 32228 平均a353 355 2 aSE=3.2, P0.2。 247 试验3 从粗磨高粱试样和细磨高粱试样所得葡萄糖量列于表3。粗磨试样所得葡萄糖值较低(P0.01)，CV较高。故确定本法将试样进行细磨(通过1mm筛网)后分析测定。 表3 样品粒度对葡萄糖释放量的影响(试验3) 筛 网 高粱样品 mm 2mm 差 值 葡萄糖mg/g样品 8
16、8 64 24 126 77 49 145 78 67 304 273 31 328 242 86 491 388 103平均a247 187 60 CVb4.6% 7.8% a粒度间有差异(P0.01),SE=5.3 b样品内 试验4 摇动次数对葡萄糖释放量的影响示于图2。葡萄糖量先是随摇动次数增加而增加，摇动三次以上葡萄糖量持平。因此确定本测定方法摇动5次(最初一次之后每15分钟摇动一次)。如改用一个持续摇荡装置可能更好。 试验5 如表4所示，在pH4.454.55范围，脱支酶缓冲液的pH值对葡萄糖释放量没有影响(P0.2)，据此将本法缓冲液pH值定为4.50.05。 248 图2 水解中摇动次数与葡萄糖释放量的关系（试验4） 表4 pH对葡萄糖释放量的影
