《双缩脲法测定蛋白质PPT演示课件》由会员分享,可在线阅读,更多相关《双缩脲法测定蛋白质PPT演示课件(25页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、1,生物化学与分子生物学实验,2,实验记录,实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作,每一次实验过程中都应当养成良好的习惯,及时做好记录和总结。 要求: 真实性 原始性 完整性 条理性,实验报告的书写,实验结束后,应及时整理和总结实验结果,写出实验报告。完整的实验报告应包括:实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结论等项目。,3,实验室规则,上实验课时不迟到,不早退,自觉遵守课堂纪律,上课时应保持实验室安静,不得大声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。 实验课前认真预习有关课程,明确实验目的、要求和注意事项,熟悉实验内容和方法步骤。 实验时应遵守实验操
2、作规程,按教师要求,认真操作。要细心观察实验现象,认真记录实验数据,作出结论,最后写出实验报告。 要爱护公物,小心使用仪器和实验设备,注意节约用水、电、药品和器材。 所有固体废弃物如:废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中,用水稀释后倒入水槽。,4,实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕,立即盖严并还原。实验完毕,仪器洗净放好。 在实验过程中必须遵守操作规程,不得随意乱动乱用。如不会使用,应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备,造成事故者,按有关规定进行赔偿和处理。 严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰,实验室内学生轮流安排值日,实验结束
3、离开实验室之前,关好窗户,切断电源,水源,确保安全。,5,试剂使用规则,使用试剂前应该仔细辨认标签,看清名称及浓度,是否为本实验所需。 取出试剂后,立即将瓶塞盖好,放回原位;未用完的试剂决不可倒回原瓶。 取标准溶液时,应该将标准溶液倒入干试管中,再用干净吸管吸取标准液,以免污染瓶中的标准液体。 使用滴管时,滴管尖端朝下,避免试剂流入橡皮帽内。 使用有毒试剂及强酸强碱时,尽可能用量筒取,若用吸管只能用吸耳球取,切勿用嘴吸取,以免造成意外。,6,吸量管的使用,正确拿法:中指和拇指拿住吸管上端,食指顶住吸量管顶端。 取液:用吸耳球吸取液体至刻度上,眼睛看着液面上升;吸完后用食指顶住吸量管上端。 调刻
4、度:吸量管与地面保持垂直,下口与试剂瓶接触,并成一角度;用食指控制液体下降至最上一刻度处;液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 放液:吸量管移入准备接受溶液的容器中,使其出口尖端接触器壁,并成一角度,吸量管仍保持垂直。放开食指,使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。,7,吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后,还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”,未标“吹”字的吸量管,则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹) 吸量管尖应接触受器内壁,但不应插入受器内的原有液体之中,以免污染吸量管及试剂。 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管,用后应及时用自来水冲洗
5、干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗,待实验完毕后,用自来水冲洗干净,晾干备用。,吸量管的使用注意事项,8,玻璃器皿的一般清洗方法 一般玻璃仪器:如试管、烧杯、锥形瓶等,先用自来水洗刷后,用洗衣粉刷洗,再用自来水反复冲洗,最后用蒸馏水淋洗23次。干燥备用。 容量分析仪器:吸量管、滴定管、容量瓶等,先用自来水冲洗,待晾干后,再用铬酸洗液浸泡数小时,然后用自来水充分冲洗,最后用蒸馏水淋洗23次,干燥备用。 比色杯:用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时,用盐酸或适当溶剂冲洗,再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗,切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。 上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为
6、干净的标准)后,根据需要晾干或烘干。,9,分光光度法,光是一种电磁波,通常用频率和波长来描述光。 人的视觉所能感觉到的光称为可见光,波长范围在400760nm,人的眼睛感觉不到的还有红外光(波长大于760-5000000nm)、紫外光(波长200-400nm)、X射线等。 在可见光区,不同波长的光呈不同的颜色,但各种有色光之间并没有严格的界线,而是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。,溶液的颜色与吸收光颜色的关系,一般性实验-1,10,Beer-Lambert定律吸收光谱法基本定律,11,光吸收示意图,12,吸收光谱和物质的定性分析,物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 吸收光谱曲线是物质的特征曲线
7、。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度(Absorbance),然后以波长()为横轴,相应的吸光度(A)为纵轴,按结果作图,可得到该物质的吸收光谱曲线,这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中,往往可找到一个或几个吸收最大值,该处的波长称为最大吸收波长(max)。物质不同,它们的最大吸收波长也往往不同。,13,不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收,14,原理:根据物质对于入射光的特征吸收,可应用于物质溶液的定性检测 比较吸收光谱曲线:在相同的条件下,吸收光谱曲线不同,表明物质的化学结构不同。 比较
8、最大吸收波长:不同物质的最大吸收波长不同;化学结构相似的物质最大吸收波长相同,吸收系数不同。 比较吸光度的比值:多用于检测物质的纯度(DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定),物质定性分析常用方法,15,物质的定量分析,标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液,用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白溶液调节透光率100%,然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线,叫做标准曲线(或称A-C曲线)。 标准管法 对个别样品进行测定,且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。 A标 =K标c标b标 A测 =K测 c测 b测 c测 =A测
9、 /A标 c标,16,分光光度计的基本构造,仪器中光源经过单色器中的单色原件(如棱镜),所得到的单色光(入射光)进入样品室,透出的光被受光器(光电池或光电色)产生光电流,放大后在测量仪上显示出吸光度(A)或透光度(T)。,17,722分光光度计使用方法,接通电源,打开仪器电源开关,打开样品室盖,预热10min; 将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁,放入样品室内, 空白液一般放于最外格,样品比色杯放入位置与试管位置对应; 调好波长; 调节按钮 开盖时,调 T 参数 调为 100 合上盖,调 A 参数 调为 0; 逐步拉出样品室拉杆(听到“咔”一声),读取吸光度值(
10、A); 读数完打开样品室盖,再将读数写入记录本。,18,722分光光度计使用注意事项,样品室盖应轻开轻放; 比色皿拿其磨砂面,液体装入约3/4高度,并用擦镜纸擦净外壁,每次用完后自来水冲洗干净,倒置于滤纸上; 倒取试剂时不能在仪器表面上方操作,仪器上请勿放任何物品; 每调换一次波长,都应将空白溶液的吸光度调至“0”。,19,双缩脲法测定蛋白质含量,实验目的 了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法。,20,蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应,生成紫红色化合物,称为双缩脲反应。 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应,蛋白质在碱性溶液中,能与Cu2+形成紫红色络合物,颜色
11、深浅与蛋白质浓度成正比,故可以用来测定蛋白质的浓度。 在一定的浓度范围内,颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。,实验原理,21,紫红色铜双缩脲复合物分子结构,22,在分光光度法中,许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质,使之能进行比色测定,并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中,将待测组分转变成有色化合物的反应叫做显色反应,与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。 在实际分析中,同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应,生成不同的有色物质。为了保证测定的灵敏度和准确度,在分析时常需对显色反应进行选择,选择原则如下: 1. 选择性好,干扰少或干扰易消除; 2. 灵敏度要高; 3. 生成有色化合物的组成恒定,化学性质稳定; 4. 生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别,最大吸收波长之差大于60nm。,显色剂与显色反应,23,实验步骤,1.按下图表所示加入相应的试剂或样品,24,各管混匀后加入双缩脲试剂3.0ml,充分混匀; 37度水浴30min; 在540nm 处以0号管调零点测定各管吸光度; 绘制标准曲线:以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标; 对照标准曲线,求待测蛋白质浓度。,25,读数时要注意读的是A的值; 注意正确标记试管(用记号笔清晰标记于试管2/3高处); 准确记时。,注意事项,