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1、,第六章 高效液相色谱分析法 HPLC （High Pertormance Liquid Chromatography，） 6-1概述 高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代 初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱 技术。,高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自动化 操作。 经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。,现代液相色谱法引用了气相色谱的理论， 流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径 的
2、填料填充而成，从而使柱效大大高于经典 液相色谱（每米塔板数可达几万或几十 万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可 对流出物进行连续检测。,因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离 效能高、自动化等特点。所以人们称它为高 压、高速、高效或现代液相色谱法。,二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。,色谱
3、分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。,三、液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和 气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方
4、面：,（1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。,（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 因为： 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子
5、，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。,液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱 和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而 气相色谱并不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温 度，一般有利于色谱分离条件的选择。,（3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。,综上所
6、述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。,四、HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。,第二
7、节 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。,液相色谱,分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开 泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平 直后，用微量注射器把样品注入进样口，流 动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的 组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱 液一起排入流出物收集器。当有样品组分流 过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信 号，经过放大，用记录器记录下来就得到色 谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低 的依据。,一、高压输液系统 高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表 等组成。 1.溶剂贮存器 溶剂贮存器
8、一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。,2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪 中关键部件之一，其功能是 将溶剂贮存器中 的流动相以高压形式连续不断地送入液路系 统，使样品在色谱柱中完成分离过程。由于 液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相 粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为 了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高 压泵注入流动相。,对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。 高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相
9、粘度和柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。,图6-2 往复式柱塞泵,图6-3 气动放大泵,3. 梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。,梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再
10、输至柱系统。,梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。,二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。,要将试样“浓缩地”瞬时地注入。 1.注射器进样（隔膜进样） 2.高压定量进样阀 带压进样 停流进样,图6-4 六通进样阀,二. 进样系统,三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱
11、一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 6mm，柱长为10 50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。,四、检测器 检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。,在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类 是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理 或物理化学特性有响应。属于此类检测器的 有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是 总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和 化学性质响应。属于此类检测器有示差折光 检测器等。,一、固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类
12、。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。,第三节 液相色谱的固定相和流动相,硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。,1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透
13、性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。,2. 全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类 固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较 浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别 适合复杂混合物分离及痕量分析。,二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它 对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞 争，因此，正确选择流动相直接影响组分的 分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极 性和良好的选择性。,（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测 器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截 止波长 要长。所谓
14、溶剂的紫外截止波长指当 小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此 辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学 不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折 光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最 高灵敏度。,（3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。,（4）化学稳定性好 （5）低粘度（粘度适中） 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不 利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇 和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用， 例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检 测器内形成气泡，影响分离。,三、各类色谱法简介,(一)
15、、液-固色谱法 液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。,吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构
16、体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。,1、液-固色谱法固定相 液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。,极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和 碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁 等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺 等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳 香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如 酚、羧和吡咯衍生物等。 各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅 胶，其次是氧化铝。在现代液相色谱中，硅 胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为 液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基 体。,2、液-固吸附色谱流动相 液相色谱的流动相必须符合下列要求： （1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。 （2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反
