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1、1 / 7 PCR 产物的 TA 克隆 (DNA的胶回收和连接) 【实验原理】 1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳， 不同大小的DNA 分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻 融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。 2.利用 Taq 酶能够在PCR 产物的 3末端加上一个非模板依赖的A，而 T 载体是一种带 有 3T 突出端的载体， 在连接酶作用下，可以把 PCR 产物插入到质粒载体的多克隆位点， 可用于 PCR 产物的克隆和测序。 商品化的T 载体有很多。本实验采用TaKaRa 公司的 pMDTM1
2、8-T Simple Vector 。这 个载体以pUC19 载体为基础， 消除了 pUC18载体上的多克隆酶切位点，经 EcoR 酶切后 在两侧的 3端添上“ T”制备而成（见附录1） 。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克 隆后的 PCR 产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在 PCR 扩增引物上导入合适的酶切 位点。 【试剂与器材】 （一）试剂 1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara 公司） 。 2.TAE 电泳缓冲液 3.琼脂糖（ Agarose ） 4.6 电泳加样缓冲液：0.25 溴粉蓝， 40(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4。 2 / 7 5.
3、溴化乙锭 (EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。 6.70% 乙醇 7.胶回收试剂盒（Omega公司） （二）器材 水平式电泳装置,电泳仪 ,台式高速离心机, 恒温水浴锅 , 微量移液枪 , 微波炉或电炉,紫外透 射仪 , 凝胶成像系统或其它照相设备。 【操作方法】 （一）胶回收试剂盒回收PCR 产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例） 1.当目的片段DNA 完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。 2.凝胶块转移至1.5ml离心管 (离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定 其体积（假设其密度为1g/m
4、l ） 。加入等体积的Binding Buffer （XP2） ，于 55-65 水浴 中温浴 7min或至凝胶完全融化，每2-3 min振荡混合物。 （在凝胶完全溶解之后，注意凝 胶-Binding buffer混和物的pH 值。如果其pH 值大于 8 的话， DNA 的产量将大大减少。 如果是橙色或红色，则要加入5 l 浓度为 5 M ，pH 为 5.2 的醋酸钠，以调低其pH 值。该 混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。） 3.取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml 收集管内（已备好） 。 4.将第三步获得的DNA/ 熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000
5、x g 离心 1 分钟。弃收 集管中的滤液，将柱子套回2ml 收集管内收集管。 5.如果 DNA/ 凝胶熔液的体积超过700ul ，一次只能转移700ul至柱子中， 余下的可继续重 3 / 7 复第 5 步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA 回收纯化柱都有一个极限为25 g DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。 6.弃收集管中的滤液， 将柱子套回2ml 收集管内收集管。 转移 300 l Binding Buffer（XP2 ） 至柱子中，室温下，10,000 x g下离心 1min 。 7.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml 收集管内收集管。
6、 转移 700 l SPW Wash buffer（ 已 用无水乙醇稀释的）至柱子中。室温下10,000 xg离心 1min 。 （浓缩的SPW Wash Buffer 在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果 DNA 洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中 的，须将其拿出置于室温下）。 8.重复用 700 l SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000 xg离心 1min 。 9.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml 收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心 2 min以 甩干柱子基质残余的液体。 10. 把柱子装在一个干凈的1.5ml 离心管上，加入 1530 l （具体
7、取决于预期的终产物浓度） 的 Elution Buffer(或 TE 缓冲液 )到柱基质上，室温放置1min, 13,000 xg离心 1min 以洗脱 DNA 。第一次洗脱可以洗出70-80% 的结合DNA 。 如果再洗脱一次的话，可以把残余的 DNA 洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。 （二）连接反应（以Takara 公司 pMDTM18-T Simple Vector Kit为例） 1）在微量离心管中配制下列DNA 溶液，全量为5 l。 pMDTM18-T Simple Vector 1 l Insert DNA 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l 4 / 7
8、 2）加入 5 l（等量）的Solution I。 3）16反应 30 分钟。 （2 kbp 以上长片段PCR 产物进行DNA 克隆时，连接反应时间请 延长至数小时） 。 4）全量（ 10 l）加入至100 l 感受态细胞中，冰中放置30 分钟。 5）42加热 45 秒钟后，再在冰中放置1 分钟。 6）加入 890 l LB 培养基， 37 振荡培养60 分钟。 7）在含有 X-Gal 、IPTG、Amp 的 LB 琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝 色菌落。 8）挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。 【注意事项与提示】 1.使用新鲜的电泳缓冲液TAE Buffer 。不要
9、重复使用，其PH 的升高会减少产量。 2.不论采取何种方法回收DNA ，在回收过程中，要尽量减少洗脱体积，以便提高收得率和 浓度，以方便后续操作。 3.从胶上回收DNA 时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫 外光对 DNA 的切割。 DNA 曝露在紫外灯下不能超过30 秒。 4.连接反应时间是与温度密切相关，因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用16 连接4 小时为宜，如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率；在选择反应的温 度与时间关系时，也要考虑在反应系统中其他因素的影响。 5.连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活
10、性降低，取酶 时应在冰上操作且动作迅速。7. 5 / 7 6.连接反应应在25 以下进行， 温度升高较难形成环状DNA ，影响连接效率。 长片段 PCR 产物（ 2kb 以上）进行连接时，连接反应时间应延长至数小时。 7.进行克隆时， Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为1:210 。根据实验情况选 择合适的摩尔数比。 8.用高效的感受态细胞（转化效率1108 cfu/ g pUC19 ） ，这样才可能得到比较理想的 阳性克隆。 9.试剂盒配有Control DNA。通过对照实验判断试剂盒的保存效果。 【实验安排】 第一天下午：配制6电泳加样缓冲液、TAE 等缓冲液，将各种耗材灭菌。 第二天上午：制备琼脂糖凝（1% ） ，电泳检测，切胶回收DNA 片段 第二天下午：大肠杆菌制备感受态细胞；DNA 与 T 载体连接转化大肠杆菌。 第三天上午：观察转化结果（蓝白斑情况），计算重组率。 【实验报告要求与思考题】 1PCR 产物的 T-vector克隆方法，应注意哪些操作环节？ 6 / 7 2和其他组结果比较，对本组实验结果进行分析。 3对于用高保真Taq DNA聚合酶扩增的PCR 产物，如何进行克隆？ 附录 1： 附录 2： 7 / 7
