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1、第四节 菌种的活化与扩大培养,菌种保存: 斜面冰箱, 砂土保藏法, 石蜡油封存法等. 活化与扩大培养: 将保存的处于休眠状态的生产菌种接入到试管斜面活化后,再经过茄子瓶或摇瓶以及种子罐逐步扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程. 种子: 纯种培养物,如何得到优秀的种子,转移到复活培养基的方法-存活力达到最大 接种场所-不引起种子污染的 具有定量判断种子质量标准的方法- 具有定量测定菌种一系列生理状态变化的方法 选择能满足种子扩大培养的容器和其他环境条件,2.1 实验室种子,包括: 斜面, 茄子瓶, 固体培养基, 菌体培养基, 摇瓶液体种子的制备 1)菌体的制备: 细菌、酵母菌的种子制备就是一个
2、细胞数量增加的过程。 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。 细菌培养温度大多数为37 ，少数为28 ，细菌菌体培养时间一般12天，产芽孢的细菌则需培养510天。,2) 霉菌孢子的制备,霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。 霉菌的培养一般为2528 ，培养时间为414天。,3) 摇瓶种子制备,某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐-摇瓶种子 摇瓶种子的目的：使孢子发芽长成健壮的菌体，同
3、时对斜面孢子的质量和无菌情况进行考察，择优使用。 摇瓶相当于微缩了的种子罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。 摇瓶种子种子质量判断标准：外观颜色，菌体浓度活粘度，糖氮代谢，PH、杂菌情况等指标检验。,2.2 生产车间种子制备,1.种子罐种子制备 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 1) 孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子. 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 2) 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子. 将二级种子转入发
4、酵罐内发酵，称为三级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。,2. 种子罐级数的确定,依据: 菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用 种子制备目的: 形成一定数量和质量的菌体。 发酵的目的: 获得大量的发酵产物 产物是在菌体大量形成 并达到一定生长阶段后形成的， 需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此，将 两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。 种子罐级数减少，有 利于生产过程的简化及发酵过程的 控制，可以减少因种子生 长异常而造成发酵的波动
5、。,3.种龄,种龄: 种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐 的培养时间,4. 接种量,定义: 移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例 发酵罐的接种量大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。 制霉菌素发酵的接种量为0.11 肌苷酸发酵接种量1.52 霉菌的发酵接种量一般为10， 多数抗生素发酵的接种量为715，有时可加大到2025。 例如，生产制霉菌素时用1的接种量，其效果较用10的为好，而0.1接种量的生产效果与1的生产效果相似。,5. 种子质量标准,发酵工业生产上常用的种子质量标准 细胞或菌体菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观。菌体形态可通过显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子
6、的质量要求是菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。 菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。, 生化指标种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况及变化为指标 产物生成量种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。 酶活力
7、测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。 如土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。 此外，种子应确保无任何杂菌污染。,5. 种子异常的分析,在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大的困难。种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。 菌种生长发育缓慢或过快菌种在种子罐生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中，通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。生产中，培养基灭菌
8、后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量。, 菌丝结团 在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。如果菌丝团较多，种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团，影响发酵的正常进行。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。, 菌丝粘壁 菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。以真菌为生产菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。,
