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1、2020/8/2,1,第三章,荧光分析法,2020/8/2,2,目录,3-1 概述 3-2 荧光分析基本原理 3-3 荧光分析仪器 3-4 荧光分析方法及应用,2020/8/2,3,3-1 概述,分子发光 某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射的现象。 光致发光 物质因吸收光能而激发发光的现象。 荧光 当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线荧光。,2020/8/2,4,发展史 理论： 第一次记录荧光现象：1575年，西班牙内科医生、植物学家莫纳德斯(N
2、. Monardes )提到：一种木头切片的水溶液呈“可爱的天蓝色”。 17世纪，波义尔(Boyle)和牛顿(Newton)等再次观察到荧光现象并给予了更详细的描述。 1852年，斯托克斯(G.G.Stokes)用分光光度计考察奎宁和叶绿素时发现：吸荧（斯托克斯定则），所以判断荧光是先吸光再发光，即荧光是发射光。并且根据发荧光的矿物“萤石”荧光。 此外他还研究了荧光强度与浓度之间的关系；描述了高浓度时及有外来物质存在时的荧光猝灭现象。 他也是第一个提出应用荧光作分析手段的人。,2020/8/2,5,1867年，瑞士，高贝尔斯莱德(F.Goppelsrder)进行了首次的荧光分析工作，应用铝-桑
3、色素配合物的荧光进行铝的测定。 1880年，莱伯曼(Liebeman)提出了最早关于荧光与化学结构关系的经验法则。 19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。 20世纪以来，荧光现象的研究就更多了： 1905年，伍德(Wood)发现共振荧光。 1914年，弗兰克(Frank)和赫兹(Hertz)利用电子冲击发光进行定量研究。 1922年，Wawillous 进行荧光产率的绝对测定。 1926年，盖维奥拉(Gaviola) 进行了荧光寿命的直接测定。 ,2020/8/2,6,仪器： 19世纪前，荧光观察靠肉眼。 1928年，哲蒂(Jette)和维斯特(West)研制出第一台光电荧光计。
4、 如今，已有各式各样新型的荧光分析仪问世。 荧光分析已成为一种十分重要且有效的光谱分析手段,2020/8/2,7,3-2 荧光分析基本原理,一、荧光和磷光的产生 发光 室温下，大多数分子处在基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发，跃迁到激发态，激发态不稳定，分子将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。,2020/8/2,8, 原理： 1.分子能级 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含一系列的振动能层和转动能层。 So：基态 S1:第一电子激发单重态 S2:第二电子激发单重态 T1:第一电
5、子激发三重态 T2:第二电子激发三重态 =0,1,2,3振动能层,图3.1 荧光和磷光体系能级图,2020/8/2,9,2.电子激发多重度 M s: 电子自旋量子数代数和，数值为0或1。 单重态 分子轨道中的电子都是自旋配对的,自旋方向相反. s=0，M=1 用符号S表示 三重态 电子跃迁过程中伴有自旋方向的改变 s=1，M=3 用符号T表示,2020/8/2,10,3.分子去活化 处在激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和 非辐射跃迁等去活化过程返回基态，其中以速度最快、激发 态寿命最短的途径占优势。有以下几种基本的去活化过程。 振动驰豫 内转换 荧光发射 系间跨越 磷光发射 外转换,
6、2020/8/2,11,振动驰豫 当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层S0(=0)跃迁到激发态Sn(=i)的较高的振动能层上去。然而在液相或压力足够高的气相中，分子间碰撞的几率很大，激发态分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围的分子，而自身从Sn或Tn的高振动能层(=i)失活到该电子能级的最低振动能层(=0)上，这一过程称为振动弛豫（振动松弛）。 时间10-12s Sn或Tn的i 0 ，即各振动能级间的小箭头。,2020/8/2,12,图3.1 荧光和磷光体系能级图,2020/8/2,13,内转换 相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程称为内转换。 当两个相同多重度电子能级的振动能
7、层间有重叠时，则可能发生电子由高能层电子激发态以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子激发态。如由S2 S1 ，T2 T1。 时间10-13-10-11s 分子最初无论在哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫和内转换到达最低激发单重态(或三重态)的最低振动能层上。,2020/8/2,14,图3.1 荧光和磷光体系能级图,2020/8/2,15,荧光发射 当分子处于单重激发态的最低振动能级S1(=0)时，发射一个光子返回基态S0(=i) ，这一过程称为荧光发射。 由于溶液中振动弛豫效率很高，它在荧光发射之前和发射之后都可能发生。因此发射荧光的能量比分子所吸收的能量要小，即荧光的特征波长比它所吸收的特征波长
8、要长。 时间10-9-10-7s 荧光多为S1 S0 跃迁。,2020/8/2,16,图3.1 荧光和磷光体系能级图,2020/8/2,17,系间跨越 不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程称为系间跨越。 它涉及受激电子自旋状态的改变。如S1 T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对，这种跃迁一般是禁阻的。 但如果两个不同多重度电子能态的振动能层有较大的重叠时则可能通过自旋轨道耦合等作用使其实现。,2020/8/2,18,图3.1 荧光和磷光体系能级图,2020/8/2,19,磷光发射 当从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同
9、它竞争时，分子将发生磷光跃迁回基态，这一过程称为磷光发射。 荧光与磷光的根本区别是： 荧光：由激发单重态最低振动能层至基态各振动能 层的跃迁产生。 磷光：由激发三重态最低振动能层至基态各振动能 层的跃迁产生的。 E荧E磷，荧磷 时间10-4-10s,2020/8/2,20,图3.1 荧光和磷光体系能级图,2020/8/2,21,外转换 激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用和能量转换，使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程称外转换。 这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。 由较低的激发单重态及较低的三重态的非辐射跃迁可包含外转换，也可包含内转换。,2020/8/2,22,图3.1 荧光和磷光体系能
10、级图,2020/8/2,23,二、激发光谱和发射光谱 任何荧光(磷光)化合物都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。它们是荧光(磷光)定性和定量分析的基本参数和依据。 激发光谱 选择：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可从它们的激发光谱曲线来确定。 绘制：固定测量波长（选荧光/磷光的最大发射波长），改变激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，即得到荧光(磷光)化合物的激发光谱。,2020/8/2,24,激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样。这是因为物质分子吸收能量的过
11、程就是激发过程。 发射光谱：荧(磷)光光谱 绘制：将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧(磷)光强度，即得到荧(磷)光发射光谱。 例：图3.2为萘的激发光谱、荧光发射光谱和磷光发射光谱。荧光发射光谱显示了若干普遍的特性：,2020/8/2,25,Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。 这是由于受激分子通过振动弛豫而失去振动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此在激发和发射之间产生了能量损失。,图3.2 萘的激发光谱I、荧光II和磷光光谱III,激发/吸收光谱,磷光光谱,荧光光谱,
12、2020/8/2,26,荧光发射光谱的形状与激发波长无关。 这是因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。 由于较高激发态通过内转换及振动弛豫回到第一电子激发态的速率是很高的，远大于由高能激发态直接发射光子的速率。 故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光激发，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。,2020/8/2,27,镜像规则 荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层所致。其形状决定于第一电子激发态中各振动能层的分布情况。 荧光光谱是
13、激发分子从第一电子激发态的最低振动能层回到基态中各不同能层所致。所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情况。 基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布的情况是类似的，因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。,2020/8/2,28,图3.3 蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）,2020/8/2,29,三、荧光和分子结构的关系 分子产生荧光必须具备两个条件： (i)分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光。 (ii)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率。 思考：什么样结构的物质会发生荧光？ 化学结构上的改变对物质荧光强
14、度和荧光光谱 有什么样的影响？,2020/8/2,30,荧光量子产率 :,它表示物质发荧光的能力,许多吸光物质并不能发荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除荧光发射外，还有许多上面提到的辐射和非辐射的跃迁过程与之竞争。荧光的量子产率与上述的每个过程的速率常数有关。表达式如下,荧光发射过程的速率常数,其他有关的过程速率常数总和,凡是可以使 升高， 降低的因素都可以增强荧光 主要决定于化学结构， 主要决定于化学环境，也与化学结构有关。,2020/8/2,31,跃迁类型 实验表明，大多数荧光化合物都是由或跃迁激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或跃迁而产生荧光，其中的跃迁的量子效率较高
15、。 此外，在 跃迁过程中，通过系间跨越跃迁至三重态的速率常数也较小，也有利于荧光的发射。 共轭效应 含有跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强。这种体系中的电子共轭度越大，则电子非定域性越大，越易被激发，荧光也就越易发生，而且荧光光谱将随共轭程度的增加向长波移动。,2020/8/2,32,绝大多数能发生荧光的物质含有芳香环或杂环。 任何有利于提高电子共轭度的结构改变都将提高荧光效率，并使荧光波长向长波方向移动。 刚性平面结构 实验发现多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小，减少了碰撞去活的可能性。,酚酞,荧光素,无荧光,
16、强荧光,氧桥,2020/8/2,33,取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。 给电子基团，如-0H、-OR、-NH2、-CN、-NR2等，使荧光增强。 吸电子基团，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、卤素离子等，会减弱甚至猝灭荧光。 如果将一个高原子序数的原子引入到电子体系中，往往会增强磷光而减弱荧光。 “重原子效应”增加系间跨越速率所致。,2020/8/2,34,如，卤代苯中 双取代和多取代物对非定域电子激发的影响较难预测。但若能增加分子的平面性，例如取代基之间能形成氢键，则荧光增强；反之，则荧光减弱。,溴苯,无荧光,氟苯,氯苯,碘苯,2020/8/2,35,四、溶液的荧(磷)光强度 荧光强度与溶液浓度的关系 荧光量子产率 荧光强度If与溶液浓度c的关系： 根据Beer定律，经推导可得： 当I0和 一定时：,吸收的光量
