核酸提取原理及常见问题第一部分： DNA提取方法简介第二部分： DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分： RNA提取方法简介第四部分： RNA提取常见问题、原因 分析及其对策q 基因组 DNA的提取Ø CTAB法Ø SDS法Ø 酚氯仿 法Ø 试剂 盒法DNA提取的几种方法提取的几种方法q CTAB法 原理Ø CTAB， 是一种阳离子去污剂 ， 可破碎细胞壁和 细胞膜 ， 并与核酸形成复合物Ø 在高盐溶液中 ( 1.4 mol / L NaCl ) 是可溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定程度 ( <0.7 mol /L NaCl )时 ,从溶液中沉淀 通过 离心 , 可将 CT A B — 核酸 复合物同蛋白质 、 中性 多 糖类物质分开 Ø 溶解 于高盐溶液中的 CTA B — 核酸 复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 ,而 CT A B 则溶于乙醇 .注： CTAB溶液在低于 15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15℃ CTAB法 （植物 DNA提取经典方法）q CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl （ pH8.0）EDTA （ pH8.0）NaCl CTAB β-巯基乙醇终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（ V/V）使用前加入Ø Tris-HCl （ pH8.0） 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；Ø EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNase活性；Ø NaCl 提供一个高盐环境，使 DNP（脱氧核糖 核蛋白）易于溶解。
Ø CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；Ø β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除ß 细胞裂解后释放的植物次生代谢 产物和多酚 类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合 到DNA 分子上而致 D N A 降解；ß 多糖 的性质与核酸类似，会与核酸一同沉淀下来，影响 植物核酸 纯度q CTAB提取缓冲液的改进配方组份 Tris-HCl （ pH8.0） EDTA （ pH8.0）NaCl CTAB PVP β-巯基乙醇终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 2-5%(W/V) 1-5%（ V/V）使用前加入v PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖 v 同时 向抽提液中加入还原剂 β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除 改良方法 1改良方法 2ß 加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞，去除部分杂质，离心得到细胞核；ß 针对多糖组织，得到细胞核之后可加入 1XPBS清洗 2-3次，去除多糖；ß 后续使用 CTAB裂解液裂解细胞核。
ß 核酸分离缓冲液： 200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl2%PVPq CTAB法流程图植物材料 裂解液上层溶液液氮研磨 抽提细胞裂解 干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液q SDS法原理SDS法法Ø SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（ 55～ 65℃ ）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；Ø 提高盐 (KAc或 NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；Ø 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA组份 Tris-HCl （ pH8.0）EDTA （ pH 8.0 ）NaCl SDS终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法 DNA提取缓冲液ß SDS 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较 高分子 量 DNA ,但所得产物含糖类杂质 较多ß CTAB法 的最大优点是能较好地去除糖类杂质q SDS法 流程图动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀 DNA溶液酚氯仿裂解法q苯酚抽 提原理：Ø 使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相Ø 酚的优点： 1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了 DNase的 降解作用Ø 酚的缺点 ： 能溶解 10-15%的 水 最后 用氯仿抽提 ： 克服酚的缺点；加速有机相与液相 分层；去除 核酸 溶 液 中的迹量酚酚易溶于氯仿中 ）用酚－氯仿抽提细胞基因组 DNA时，通常要在酚 -氯仿中加少许 异戊醇，减少 蛋白质变性操作过程中产生的气泡异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定用乙醇沉淀 DNA时 ，通常 要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc， Na+中和 DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀DNA提取常见问题提取常见问题1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2. DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3. DNA中残留有金属离子1. 重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等 杂质2. 重新 沉淀 DNA，让酒精充分挥发3. 增加 70％乙醇洗涤的次数（ 2-3次）q问题一： DNA样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应。
原 因对策1. 材料不新鲜或反复冻融2. 未很好抑制内源核酸酶的活性3. 提取过程操作过于剧烈， DNA被机械打断4. 外源核酸酶污染5. 反复冻融1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的 DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6. 将 DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融q问题二： DNA降解对策原 因1. 实验材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分3. 沉淀不完全4. 洗涤时 DNA丢失1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2. 动植物要匀浆研磨充分； G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3. 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加 PK的用量）4. 低温沉淀，延长沉淀时间5. 加辅助物，促进沉淀6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒q问题三： DNA提取量少对策原 因q RNA的提取Ø 异硫氰酸胍 /苯酚法（如 Trizol法）Ø CTAB法Ø 试剂 盒法RNA提取q 异硫氰酸胍 /苯酚法Ø 原理：• 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；• 释放出来的 DNA和 RNA由于在特定 pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；• 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净 RNA。
ß Trizol法适用于普通的植物组织、动物组织以及真菌和细菌等• 酚类化合物被氧化后会与 RNA不可逆地结合，导致 RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时 RNA的丢失，或形成不溶性复合物；• 而多糖会形成难溶的胶状物，与 RNA共沉淀下来；萜类化合物和 RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解ß 针对多糖多酚植物，可以采用 CTAB法和Trizol法结合的方法，针对性的去除多糖多酚ß 对于富含色素、蛋白和多糖的藻类，可采取试剂盒方法ß 组织量 较少的样品，在沉淀时刻加入糖原，增加终浓度等影响影响 RNA提取的因素提取的因素q 材料 ：Ø 新鲜，切忌使用反复冻融的材料Ø 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔可以先将材料贮存在 TRIzol或样品贮存液中，于 － 80℃ 保存Ø 液氮 长期保存 ，－ 80℃ 短期保存q 样品破碎及裂解 ：Ø 根据不同材料选择不同的处理方法：• 培养细胞： 通常可直接加裂解液裂解• 酵母和细菌 ： 直接液氮研磨，之后用 Trizol裂解• 动植物 组织： 先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解 有些样品如肌肉或者动物脏器需要加入裂解液后进行湿磨，以充分研磨。
• 为 减少 DNA污染，可适当加大裂解液的用量q 纯化：Ø 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；Ø 经典 的沉淀方法 ，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解 ；Ø 异丙醇 沉淀，用时短，但所获得的 RNA杂质较多；Ø 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择 RNA提取常见问题提取常见问题q RNA 的降解 q OD260 /OD280 比值偏 低q 总量 偏低RNA降解降解Ø 样品 取样以及保存是否得当Ø 裂解液的质量Ø 外源 RNase的污染Ø 裂解液的用量不足Ø 组织裂解不充分Ø 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等 )，很难避免 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低q 蛋白质污染：Ø 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够Ø 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底Ø 苯酚残留：Ø 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够q 抽提试剂残留：Ø 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。
Ø 设备 限制：Ø 测定 OD260 及 OD280 数值时，要使 OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间此范围线性最好q 用水稀释样品：Ø 测 OD 时，用水 作为稀释液将导致比值的降低 总量偏低ß 跟组织本身的 RNA丰度有关，一般代谢旺盛的组织 RNA得率会比较高ß 解决方案：加入糖原，帮助 RNA沉淀多提几管，最后合并溶解正常条带常见的几种 RNA条带植物叶片水生生物和昆虫等 “ 隐裂 ” 现象真菌和细菌等动物组织谢谢。