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1、蛋白质芯片技术,目 录,一 蛋白质芯片技术产生的背景 二 蛋白质芯片的概念 三 蛋白质芯片的主要特点 四 蛋白质芯片的分类 五 蛋白质芯片技术的简要操作步骤 六 蛋白质芯片的应用,一 蛋白质芯片技术产生的背景,随着人类和其他生物的全基因组序列的完成，人们开始认识到基因仅仅是生物体遗传信息的载体，而生命活动的执行者、表观性状的体现者则由基因编码的产物蛋白质所行使。基因只是一种编码，由它指导细胞合成蛋白质，而几乎所有的生物化学反应均发 生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质参与，所有的外在表现均由种类繁多的蛋白质所决定。,随着分子生物学技术的发展，生物芯片技术研究工作不断深入，DNA芯片技术被逐渐用于
2、对生物样品中核酸序列表达的检测和比较研究。 随着DNA芯片技术的不断成熟，以及基因研究所取得的令人瞩目的成果，进一步推动蛋白质功能的研究及相关技术的发展，蛋白质芯片技术因此应运而生。,二 蛋白质芯片的概念,蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白质阵列在一种高密度的固相载体上，并与待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性质、特征以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用的方法。,三 蛋白质芯片的主要特点,1.高通量 2.灵敏度较高 3.重复性好 4.操作自动化,四 蛋白质芯片的分类,按蛋白质性质分类 1.无活性芯片：将已经合成好的蛋白质以高密度阵列点样在芯片上，进行杂交反应。 2.有活性芯片：把生物体直接点在芯片
3、上，并原位表达蛋白质。 按形式分类 1.玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建） 2.3-D胶芯片（在多孔凝胶垫上构建） 3.微孔芯片（在微孔板上构建）,不同种类的蛋白质芯片的特点,五 蛋白质芯片技术的简介,操作步骤,提出生物学问题 （实验目的）,样品预处理 （重组蛋白，制备一、二级抗体， 荧光标记，配蛋白印记缓冲液）,生化反应 化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件,检测 （荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）,数据分析和建模 （图象量化，标准化， 采集蛋白信息，建立模型）,3,蛋白质芯片制备,6,1,（一）蛋白质芯片的制备,一 固相载体及其处理载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）二 蛋白质的预
4、处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解三 点制微阵列可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等四 固定微阵列上的蛋白样点膜为载体：芯片放入湿盒,37C 1h载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白 五 微阵列的封闭主要封闭试剂：BSA,（二）抗原抗体的固化,1 化学性固定 化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属离子、混合离子等 2 生物性固定 生物性配基包括受体、配体、酶、抗体-抗原等,（三）捕获分子,1 抗体 由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰度及确定新的蛋白质。 2 寡聚核苷酸 适配体,即寡聚核苷酸 能
5、够作为捕获分子用于连接蛋白质，并且有很高的特异性和亲和力。 3 肽样寡聚体 鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。,4 小分子配体 制备捕获分子最为有效的方式 小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行 5 重组蛋白 纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子，特别是应用于在蛋白质功能分析方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质-小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合蛋白的形式，从体外表达的细菌系统中分离纯化。,（四）微阵列设计与制备,1 人工制备芯片 主要有两种,即手工点样和免疫打点印迹装置。 存在着的明显问题是不能够建立高密度芯片
6、、样品和捕获分子消耗大和敏感性较低 2 微阵列制备仪 主要有直接接触式和非接触式两种类型,也是目前市场上常用的两种方法,（五）抗原或抗体的标记,1 酶标记 常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP) 、碱性磷酸酶(AP)等. 2 荧光物标记 荧光免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨酸荧光素、丹磺酰氯、罗丹明-异硫氰酯等。,（六）蛋白质芯片检测方法,1 以质谱技术为基础的直接检测法 如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI-TOF-MS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化,在电场力的作用下飞行,通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比,用以分析蛋白质的分子量和相对含量。 2 蛋白质标记法
7、常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱,再经相关软件分析图像,即可以获得有关生物信息。,六 蛋白质芯片的应用,1 用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-脂类等相互作用研究；特异性蛋白质的筛选；功能蛋白质组研究。 例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋白的研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷脂酰肌醇的结合蛋白。,2 疾病诊断的研究。目前，临床上应用的蛋白质芯片主要是用于检测肿瘤标志物的蛋白质芯片。它的应用范围主要在以下几个方面： （1）用于肿瘤患者的辅助诊断、疗效判断、病情监测、预后评估及判断肿瘤有无复发和转移等。 （2）用于肿瘤高危人群的定期筛查。高危人群主要是指45岁以上的人群、患各种慢性炎症和各种慢性疾病的患者、有肿瘤家族史和肿瘤高发区居民等。 （3）用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生物学研究。,3 抗体筛查。例如，对噬菌体抗体库一次可对上万个不同的抗体克隆进行检测。 4 药物筛选、药代动力学研究。 5 在毒理学中的应用。 6 环境监测。 7 食品卫生安全的监测。,谢谢观赏,
