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1、中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测 2020 6 11 1 2020 6 11 2 3 参考标准 中东呼吸综合征冠状病毒 MERS CoV 实验室检测技术指南WHO LaboratoryTestingforMiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus interimrecommendations revised September2014 USCDC InterimGuidelinesforCollecting Handling andTestingClinicalSpecimensfromPatientsUnderInvestigation PUIs for
2、MiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus MERS CoV Version2 2020 6 11 MERS CoV感染标本采集对象 中东呼吸综合征冠状病毒感染疑似病例 临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例 其它需要进行MERS CoV感染诊断或鉴别诊断者 2020 6 11 4 5 标本采集要求 从事MERS CoV检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训 培训合格且具备相应的实验技能 在标本采集过程中 采样人员进行安全防护 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集 密切接触者标本由当地疾控机构负责采集 根据实验室检测工作的需要
3、 结合病程再次采样 2020 6 11 采集标本种类和要求 呼吸道 上 下呼吸道 和其他样品 血清 尿液和粪便 尸检标本 每个病例应尽可能同时采集上 下呼吸道标本 下呼吸道标本最佳 建议同时采集粪便和尿液标本 应尽可能采取发病初期和恢复期双份血清标本以确定是否感染 双份血清样品间隔14 21天采集比较理想 第一份血清应在发病第一周内采集 但单份样品的检测对于确定疑似病例也有价值 如果只能采集一份样品 应该在出现症状后至少14天采集 2020 6 11 6 7 标本的保存 样品采集后应尽快送至实验室 运输过程需合理 若呼吸道样品72小时以上才能到达实验室 强烈推荐将样品储存在 80 并使用干冰进
4、行运输 应避免样品反复冻融 从全血分离的血清应4 储存并运输 或用干冰 液氮冷冻并运输 由于无霜冰柜温度波动较大 应避免使用无霜冰柜储存呼吸道和血清样品 2020 6 11 院内转运时 标本应该放置在耐用 防渗透的二级容器中进行转运 为减少任何标本破 漏的风险 不要使用任何气动传输系统来转运任何可能疑似患者标本 转运至CDC的MERS CoV标本应该充分包裹 转运时不能开盖或分装标本 标本转运应该符合三重包装系统要求 内层是主要的容器 一个可密封的标本袋缠绕以可吸收材料 第二层是防水 防渗漏的容器 外层是用于转运的包装 MERS CoV感染标本包装和运输 2020 6 11 8 MERS Co
5、V感染实验室检测方法 核酸检测 为目前早期诊断 早期发现MERS CoV感染病例的主要检测方法 采用Real timePCR进行病毒核酸检测和诊断 患者呼吸道样本中扩增到特异性核酸 可确诊MERS CoV感染 传统RT PCR因易出现污染使用受限 但可以获得病毒基因序列 抗原抗体检测 IgM捕获法ELISA检测血清特异性IgM抗体间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗体利用假病毒进行中和抗体检测 2020 6 11 9 2020 6 11 10 MERS CoV的实验室检测靶标 目前病毒核酸的检测方法主要有 检测E蛋白上游基因 upE ORF1b ORF1a N2基因四种 这些方法均高度敏
6、感 推荐upE检测用于初筛 检测ORF1b基因的方法不如针对ORF1a的方法敏感 但比其更加特异 N2基因检测具有较高的灵敏性 另外 已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组中位于RNA依赖的RNA聚合酶 RdRp 和衣壳蛋白 N 基因的几个适合测序验证的靶序列 2020 6 11 11 巢式PCR 普通PCR PCR产物电泳或测序 逆转录 获得cDNA 核酸提取 标本采集 PCR检测 荧光定量PCR 实验方案 2020 6 11 12 待检样品 upE特异性RT PCR检测 阳性 阴性 ORF1aRT PCR检测 阳性 阴性 确诊 RdRp测序或N测序 阴性 抗原检测抗体检测病毒分离 阳性 实验
7、流程 2020 6 11 13 2020 6 11 14 upEupE Fwd5 GCAACGCGCGATTCAGTT 3 upE Rev5 GCCTCTACACGGGACCCATA 3 upE Prb5 FAM CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG TAMRA3 ORF1bORF1b Fwd5 TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT 3 ORF1b Rev5 TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG 3 ORF1b Prb5 FAM CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT TAMRA3 ORF1aORF1a Fwd5 CCACTACTCCCATTTC
8、GTCAG 3 ORF1a Rev5 CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA 3 ORF1a Prb5 FAM TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT TAMRA3 N2N2 Fwd5 GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC 3 N2 Rev5 TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT 3 N2 Prb5 FAM ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG BHQ 3 分子检测引物与探针 2020 6 11 15 Y 3 56x 39 19R2 0 988 1e61e41e31e2 2020 6 11 16 荧光定量RT PCR检测结果判断 阴性 无Ct值或Ct
9、为40 阳性 Ct值 37 可报告为阳性 Ct值在37 40之间的样本建议重做 若重做结果Ct值 37 该样本判断为阳性 否则为阴性 2020 6 11 17 MERS CoV核酸检测结果报告 在实验室要确认一个样本为阳性 需要满足以下两个条件的其中一个 至少两种MERS CoV特异性PCR结果阳性 一种PCR结果为阳性 另外一种PCR产物序列测序 与MERS CoV序列相符 当针对MERS CoV的两种不同的检测方法结果不一致的时候 应当采用反转录PCR扩增 对扩增产物进行测序以确认检测结果 2020 6 11 18 检测结果判读 阴性结果也不能排除临床病人的感染 一些因素可能产生假阴性 包
10、括 样本质量差 比如口咽等部位的呼吸道样本 样本收集的过早或过晚 没有正确的保存 运输和处理样本 技术本身存在的原因 如病毒变异 PCR抑制等 当PCR检测结果为阴性 但临床表现和流行病学特点提示是MERS CoV感染时 可采用血清学方法进行检测 双份血清标本能够满足血清学检测的要求 2020 6 11 19 我国首例输入性中东呼吸综合征病例的实验室快速确诊 2015年5月27日晚10时世界卫生组织向中国卫生计生委通报 韩国1例确诊中东呼吸综合征 MERS 病例的密切接触者经香港入境广东省惠州市 5月28日下午 经广东省疾控中心对病例标本进行核酸检测 初筛结果为阳性 样本接收时间 2015 5
11、 29日凌晨1点40分 中国疾控中心病毒病所 实验室确诊结果上报 2015 5 29日凌晨5点40分 2020 6 11 20 疑似MERS CoV感染的实验室快速确诊 样本来源 KIMMYEONGSHIK 韩国 广东省惠州市样本类型 鼻咽拭子 3份 血清 1份 采样日期 2015 5 28实验室复核检测流程 BSL 3实验室 分装灭活BSL 2实验室 核酸提取荧光定量RT PCR 三个靶标UpE ORF1b和N2 结果判定与报告 2020 6 11 21 广东省CDC疑似MERS CoV感染的复核检测 UpE检测扩增曲线 ORF1b检测扩增曲线 N2检测扩增曲线 2020 6 11 22 疑
12、似MERS CoV感染的送检样本复核检测 荧光定量RT PCR检测结果 Ct值 2020 6 11 23 结论 采用upE ORF1b N2三个靶标 进行三种荧光定量RT PCR扩增 在对照成立的基础上 三管咽拭子样本检测结果皆为阳性 基于N2靶标的荧光定量RT PCR扩增 血清标本呈弱阳性 结论 广东疑似MERS CoV病人实验室检测确定为MERS CoV感染阳性 2020 6 11 24 上海辉瑞合作研发试剂盒 单管双靶标 应用验证 MERS CoVRNA双色检测试剂盒ORF1b upE FAM VIC 2020 6 11 25 基于浊度仪和羟基萘酚蓝颜色变化的简单快速和灵敏的环介导逆转录
13、等温扩增技术 RT LAMP检测方法的特异性浊度图和显色图 特异性高 检测下限分别为每管反应500与1000拷贝 有望应用于MERS CoV感染的快速筛选 具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力 2020 6 11 26 RT PCR扩增RdRp或N基因后测序检测MERS CoV RdRpSeqassay EMC SeqRdRP Rev GCATWGCNCWGTCACACTTAGGEMC SeqRdRP Fwd TGCTATWAGTGCTAAGAATAGRGCEMC SeqRdRP Rnest CACTTAGGRTARTCCCAWCCCAW A T N A C T G R A GFrag
14、mentsize firstround 242bp includingprimers secondround228bp includingprimers Nseqassay EMC SeqN Fwd CCTTCGGTACAGTGGAGCCAEMC SeqN Rev GATGGGGTTGCCAAACACAAACEMC SeqN Fnest TGACCCAAAGAATCCCAACTACFragmentsize firstround 306 312bp includingprimers secondround279 285bp includingprimers Reference Corman M
15、lleretal Eurosurveillance Volume17 Issue49 06December2012 2020 6 11 27 28 通用引物检测冠状病毒 冠状病毒通用引物RT PCR扩增产物电泳 One stepRT PCRassays OneStepRT PCRkit QIAGEN 反应条件 1 反转录 50 for30min2 PCR扩增 95 for15min 激活 50cycles 30secat94 30secat48 1minat72 最后延伸72 for10min 引物对序列 Cor FW 5 ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC 3 Cor RV 5
16、TCRCAYTTDGGRTARTCCCA 3 2020 6 11 29 IFA抗原片检测MERS CoV特异抗体 2020 6 11 2020 6 11 30 中和抗体检测 利用MERS CoV假病毒体系进行中和抗体检测 实验操作简单而不受BSL 3实验室的限制 VirologyJournal 2013 10 1 266 2020 6 11 31 中国CDC目前实验室检测相关技术储备与培训 已引进MERS CoV病毒毒株 建立分子检测技术 形成SOP 成功完成了广东MERS CoV疑似病例的实验室复核工作 完成病毒全基因组的测序 建立MERS CoV假病毒检测中和抗体的技术 撰写并颁布 中东呼吸综合征冠状病毒 MERS CoV 实验室检测技术指南 组织召开2期全国中东呼吸综合征冠状病毒 MERS CoV 实验室检测技术培训班 参与培训人员来自中国疾控中心与各省市疾控中心及不明原因肺炎网络实验室管理与技术人员 并发放检测试剂盒数千人份 2020 6 11 32 谢谢 2020 6 11 33
