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1、 第三节 实验相关试剂和缓冲液的配制表2.3 1ml细胞裂解液的配制方法组分浓度NaClTris ( pH 8.0 )150 mM50 mMTriton X10 lAprotininLeupeptin5 l5 lPMSF1 mM表2.4 SDS-PAGE凝胶的配制方法分离胶(8ml)浓缩胶(4ml)Acrylamide concentration30% Acrylamide mix1.5 M Tris pH 8.81 M Tris pH 6.8H2O10% SDS10% Ammonium PersulfateTEMED10%2.67 ml2ml2.72 ml80 l80 l6 l12%3.2
2、ml2 ml2.64 ml80 l80 l8 l4%0.54 ml0.5 ml1.2 ml40 l40 l3 l表2.5 SDS-PAGE电泳缓冲液配制方法组分浓度Tris baseGlycineSDS0.025 M0.25 M0.1% (W/V)表2.6 转膜缓冲液的配制方法组分浓度Tris baseGlycineMethanol25 mM0.2 M20%表2.7 TBST漂洗液的配制方法组分浓度NaClTris-HClTween 20150 mM20 mM0.05% (V/V)表2.8 细胞质蛋白提取液的配制方法组分浓度HEPES10 mMMgCl21.5 mMKCl10 mMDTT0.5
3、 mMNP-400.05% 表2.9 细胞核蛋白提取液的配制方法组分浓度HEPES5 mMMgCl21.5 mMEDTA0.2 mMDTT0.5 mMglycerol26% 表2.10 1L的PBS缓冲液的配制方法组分含量KCl8 gNaCl0.2 gNa2HPO42H2O1.78 gKH2PO42.7 g表2.11 500ml TBE缓冲液的配制方法组分含量Tris base2.7 gBoric acid1.375 gEDTA（0.5M PH=8.0）1 ml表2.12 明胶酶谱洗脱液的配制方法组分浓度Triton X2.5%Tris-HCl (PH=7.4)50 mMCaCl25 mMZn
4、Cl21 mM表2.13 明胶酶谱孵育液的配制方法组分浓度Sodium Azide0.01%Tris (PH=7.4)50 mMCaCl25 mMZnCl21 mM表2.14 明胶酶谱染色液的配制方法组分浓度Coomassie G2500.5%Ethanol30%Acetic acid10%表2.15 明胶酶谱脱色液的配制方法组分浓度Ethanol30%Acetic acid10%表2.16 5蛋白质上样缓冲液的配制方法组分浓度Tris-HCl250 mMSDS10% (W/V)BPB0.5% (W/V)甘油50% (V/V)-巯基乙醇5% (W/V)第四节 实验方法2.4.1 小鼠的小胶质细
5、胞系(BV2)和人的多巴胺能神经元细胞（SKN-SH）的培养条件小鼠的小胶质细胞是半贴壁细胞，用含有10% FBS和1%双抗（青霉素：链霉素=1:1）的Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)高糖培养液，于37、5% CO2的条件下进行培养，当细胞基本铺满培养瓶瓶底时即可传代，一般2天传代一次。人的多巴胺能神经元细胞为贴壁细胞，为了减少多巴胺能神经元细胞的分化，用含有10%FBS和1%双抗的Minimum Essential Medium （MEM）于37、5% CO2的条件下进行培养，当细胞基本铺满培养瓶瓶底时即可传代，一般3-4天传代一次。2.4.2 细
6、胞传代小胶质细胞于对数生长期并基本铺满培养瓶瓶底时进行传代，此时细胞生长状态良好。倒出培养液，分别用3mL提前37预热的PBS冲洗2次，加1mL新培养液，用手拍打细胞培养瓶，倒置显微镜下观察，当BV2细胞基本从瓶壁脱落后，用电动移液器反复吹打细胞直至成单细胞悬液状态，将细胞悬液按1:5分瓶的比例加入新的培养瓶中继续培养，一般2天传一次代。人的多巴胺能神经元细胞的传代为，于细胞生长状态良好（即处于对数生长期时）并铺满瓶底时进行传代。首先倒出培养液，分别用3mL提前37预热的PBS冲洗2-3次，然后加入约200 l左右的胰酶进行消化，将培养瓶放入培养箱中静置3 min，待细胞从培养瓶瓶壁上脱落后，
7、立即加入1ml的培养液终止消化，用电动移液器反复吹打培养液使得细胞从集落状分散成为单细胞悬液，将细胞悬液按照1:4的分瓶比例分到新的培养瓶中继续培养，一般3天左右传一次代。2.4.3 细胞冻存取对数生长期且生长良好的细胞，用37预热的PBS冲洗3次，加200l胰酶进行消化，加入预先配制好的冻存液（10% DMSO+ 20% FBS+70%培养液），用电动移液器吹打细胞成单细胞悬液，将含有细胞的冻存液分装于冻存管中，每管1 ml左右。为了减少突然降温对细胞的损害，将冻存管放入含有异丙醇的冻存盒中于-70超低温冰箱中程序降温，24小时后将冻存管转移至液氮罐中长期保存。2.4.4细胞复苏从液氮罐中取
8、出冻存管，将冻存管置于空气中一会，使得液氮能够充分气化，防止冻存管突然放于37水浴后液氮大量气化引起的爆炸。将冻存管置于37水浴中，待冻存液完全融化后，短暂低速离心（1000rpm 5min），弃上清，将下层含细胞的液体转移至培养瓶中，加入培养液于37，5% CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察，待细胞完全贴壁后，更换培养液继续培养。2.4.5细胞的药物处理将待处理细胞种于细胞培养板中，24小时后待细胞处于良好生长状态即给予药物处理。待处理化合物一般需要提前30 min预处理，然后依据实验所需给予不同处理，于不同时间点收取细胞。之后提取细胞内的总蛋白，核蛋白，质蛋白，总RNA等。蛋白质免疫印迹
9、法检测细胞内蛋白质表达量的变化，用RT-PCR检测细胞内mRNA含量的变化，用ELISA法检测细胞因子的蛋白含量。2.4.6 MTT法检测细胞存活率待处理细胞按每孔1104个细胞的浓度，100 l的体积种于96孔板中。细胞于37、5%CO2的培养箱中培养，24小时后用不同浓度的待处理化合物处理，20小时后，在每孔中加入20 l MTT（5mg/ml，用PBS配制，MTT见光极易分解，故配置时要注意避光），37孵育4个小时，弃上清，每孔中加入150 l DMSO。震荡约10 min后，将96孔板放于酶标仪中，在波长490 nm下检测其吸光度值，根据吸光度值计算出细胞存活率。2.4.7 小胶质细胞
10、NO释放量的测定将处于对数生长期的小胶质细胞按照密度为3105细胞/孔的浓度接种于12孔板中，每孔接种0.6ml，24小时后，待细胞生长状态良好，加入不同浓度的待处理化合物，预处理30 min后，加入脂多糖（LPS）至终浓度为0.2 g/ml，继续培养24小时后，取50 l细胞培养上清，分别加入50 l Griess试剂（A液：B液=1:1，A液含有1%的磺胺，5%的磷酸，B液为0.1%的-萘乙二胺二盐酸盐，A,B液需要避光保存），室温反应10min，于548 nm波长下测吸光度值，根据吸光度值和标准曲线计算出NO浓度。2.4.8蛋白免疫印迹法（western blotting）检测小胶质细胞
11、中蛋白质表达量2.4.8.1总蛋白样品的提取将药物处理过的培养板从培养箱中取出，放置于冰上，用4预冷的PBS缓冲液冲洗12孔细胞培养板2次，每孔加0.6 ml预冷的PBS（如若待检测蛋白质为磷酸化的蛋白质则PBS中需要分别按100:1的比例加入0.1M 氟化钠和2mM活化后的原钒酸钠），用移液器反复吹打培养板内的细胞或用细胞刮刮细胞，直至细胞全部悬浮于PBS中，将细胞悬液转移至1.5ml EP 管中，将EP管置于4离心机中，先以2000 rpm的转速离心3 min，再以5000 rpm的转速离心5 min。倒掉PBS，向每管中加入20-40 l 蛋白裂解液（蛋白裂解液中含有2%的蛋白酶抑制剂，
12、1%PMSF，如若待检测蛋白质为磷酸化的蛋白质则蛋白裂解液中需要分别按100:1的比例加入0.1M 氟化钠和2mM活化后的原钒酸钠），每5 min用漩涡混合器剧烈震荡1次，裂解30min。7次裂解后，将EP管置于4低温离心机中，12000 rpm，离心10 min，转移含有蛋白质的上清至0.6 ml的EP管中。2.4.8.2 BCA法蛋白定量1. 将BCA定量试剂盒中A:B液按50:1的比例混合，取96孔板，每孔加入混合液200 l，再加入浓度梯度为：0、1、3、5、7 g/l的BSA蛋白标准液各1 l和待测蛋白样品1 l。2. 用微量振荡器震荡混匀30s，于37孵育30 min。3. 将96
13、孔板置于酶标仪中于562 nm波长下检测的吸光度。4. 根据蛋白标准溶液的吸光度值绘制标准曲线，进而依据标准曲线计算出待测蛋白样品的浓度。5. 在收集的蛋白样品中加入5loading Buffer，震荡混匀，置于沸水煮5 min，然后迅速置于冰上冷却，使得蛋白变性，4保存备用。2.4.8.3 SDS-PAGE电泳根据目的蛋白的分子量大小不同配制不同浓度的SDS-PAGE凝胶，分离胶配好后加到制胶板中，室温静置1小时左右，使分离胶充分凝聚。期间配置浓缩胶，浓缩胶配好后加到制胶板中，插好梳子，约1小时左右浓缩胶凝聚。从配制好的胶板中拔出梳子，将胶板置于电泳槽中，加入SDS-PAGE电泳缓冲液，将收
14、集得到的蛋白样品点入浓缩胶的原梳子孔中。将电压调至60 V，电泳约20 min左右，溴酚蓝会在分离胶和浓缩胶界面之间被压成一条细线，同时蛋白的maker会出现条带分离，之后将电压调至100 V，电泳大约1.5小时左右，停止电泳，进行转膜操作。2.4.8.4 转膜剪一块聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），使其稍稍大于待转的SDS-PAGE凝胶，将PVDF膜浸泡在无水甲醇中，使其活化。在转膜缓冲液中，按照顺序安装转膜材料，从电泳正极到负极的顺序依次是：海绵垫，滤纸，PVDF，膜凝胶，滤纸，海绵垫。将膜置于胶上，压紧并用手或玻璃棒挤出可能存在的气泡，合好夹板后放入电泳槽中，补满转膜缓冲液并放上冰盒。为了减缓转膜过程中的放热对实验的影响，最后将整个电泳槽置于冰盒中。100 V转膜1小时。转膜结束后，卸下转膜装置，取出已经转上蛋白的PVDF膜。2.4.8.5 免疫印迹反应1用TBST冲洗转上蛋白的PVDF膜，于摇床上高速洗膜2次，每次5 min。2. 漂洗完毕后倒掉TBST，加入预先用TBST配制好的5%脱脂奶粉封闭液，于摇床上低速室温孵育1小时。3. 封闭结束后，加入TBST，在摇床上高速洗膜3次，每次5 min。4. 用5%脱脂奶粉封闭液按1000:1或2000:1的比例稀释一抗。洗完膜后，弃去TBST，加入配制好的一抗稀释液，4过夜。5. 回收一抗，加入TB
