《Lecture第十一部分基因芯片(DNAMicroarrays)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Lecture第十一部分基因芯片(DNAMicroarrays)（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 核酸与核酸反应 核酸的组成 由许多单核苷酸组成的多聚物 核苷 酸是由碱基 戊糖和磷酸构成 DNA二级结 构 变性与复性 当温度升高 稳定核 酸双螺旋次级键 断裂 空间结 构破坏 变成单链结 构的过程 当温度回复正常值时 变性核酸的互补 链重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性 核酸分子杂交 应用核酸分子的变性和复性的性质 根据两条核酸单链 在一定条件下可按碱基互补原 则退火形成双链的原理 用已知的单链 核苷酸片段 作为探针检测样 本中是否存在与其互补的同源核酸 序列的方法 回顾 核酸适配体 aptamer 适配体 经体外筛选 技术SELEX 指数富集配体系统进 化 筛选 出的能特异结合蛋白质或
2、其他小分子物质的寡聚核苷 酸片段 可以是RNA 也可以是DNA 长度一般为25 60个 核苷酸 核酸适配体与靶分子结合特点 通过自适应的构象变化和 三维折叠形成特异性结合位点 适配体筛选 技术 利用分子生物学技术 构建人工合成的 单链 随机寡核苷酸文库 其随机序列长度在20 100个碱基 左右 将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用 保留结合的 寡核苷酸配基 aptamer 经反复扩增 筛选 数个循环 即 可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集 优点 体外筛选 分子较小 易人工合成 亲和力高 特 异性强 靶分子范围广 可反复变性 复性 缺点 DNA对核酸酶水解非常敏感 回顾 生物传感器生物传
3、感器 第十一章 基因芯片 DNA Microarrays 内容提要 生物芯片 基本概念 基因芯片的载体 基因芯片的探针 样本制备 杂交 信号检测 结果分析 研究现状 应用 发展方向 芯片分析的实质是在面积不大的基片 玻璃片 硅片 尼龙膜等 材料 表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址 的识别分子 反应结果用同位素 荧光法 化学发光法等显示 然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录 通过计算机分析 综 合成可读的IC总信息 11 1基本概念 Bio CPUBio CPU Samples Information 芯片分析实际上也是传感分析的组合 芯片点阵中的每 一个单元微点都是一个传感探
4、头 传感技术发展的精髓 往往都被应用于生物芯片的发展 阵列检测可以大大提高检测的效率 减少工作量 增加 可比性 11 1基本概念 芯片的分类 根据用途还可以把生物芯片分为两类 信 息生物芯片 information biochip 和功能生物芯片 function biochip 11 1基本概念 基因芯片分类 根据探针的类型和长度 基因芯片可分 为两类 其中一类是较长的DNA探针 100mer 芯片 这类芯 片的探针往往是PCR的产物 通过点样方法将探针固定 在芯片上 主要用于RNA的表达分析 另一类是短的寡核苷酸探针芯片 其探针长度为25 mer 左右 一般通过在片 原位 合成方法得到 这
5、类芯片 既可用于RNA的表达监控 也可以用于核酸序列分析 11 1基本概念 基因芯片 是通过微阵列技术 将高密度DNA片段阵列 通过机器或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其 附着在如玻璃片等固相表面 以荧光标记的DNA探针 借助碱基互补杂交原理 进行大量的基因表达及监测 等方面研究的最新革命性技术 11 1基本概念 工作原理 与经典的核酸分子杂交方法是一致的 都是 应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交 通过随后的信号检测进行定性与定量分析 能够在同 一时间内平行分析大量的基因 进行大信息量的筛选与 检测分析 微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信 息 借助此技术发展的
6、生物芯片则提供了以核酸杂交为 基础的基因水平的表达监控 多态性研究和基因分型 genotyping 从而使我们对基因表达调控有更深入的 了解 11 1基本概念 基因芯片的优点 高度并行性 提高实验进程 利于显示图谱的快速对照和阅 读 在短短的几十分钟至数小时内 就可以完成用传统方法 需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验 多样性 可进行样品的多方面分析 提高精确性 减少误差 微型化 减少试剂用量和反应液体积 提高样品浓度和反应 速率 自动化 降低成本 保证质量 基因芯片的缺点 在同一温度下杂交 不同探针杂交效率不同 11 1基本概念 芯片测定过程基本步骤 11 1基本概念 11 1基本
7、概念 载体 用于连接 吸附或包埋各种生物分子使其以水不 溶性状态行使功能的固相材料统称为载体 载体表面必须有可以进行化学反应的活性基团 以便与生物分 子进行偶联 单位载体上结合的生物分子达到最佳容量 载体应当是惰性的和有足够的稳定性 包括机械的 物理的和 化学稳定性 惰性 载体不干扰生物分子功能 稳定性 在压力或酸 碱条件下而不发生变化 载体具有良好的生物相容性 通常要有良好的光学性质 能适应投射或反射光的测量 11 2基因芯片的载体 适用于制作生物芯片的载体材料较少 通常使用玻璃片 金属片和有机高分子膜等 来源方便 表面羟基容易活化 然后能偶联DNA 酶 抗体 蛋白质 多肽等 大多数生物芯片
8、采用发光检测的方法 不管投射光还是反射光 都适合 11 2基因芯片的载体 载体活化 通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体表面 键合上活性基团 以便与配基共价结合 形成具有不同的生 物特异性的亲和载体 用来固定生物活性分子 11 2基因芯片的载体 探针的设计 如何选择芯片上的探针 确定芯片所要检测的目标对象 查询生物分子数据库 取得相应的DNA序列数据 序列对比分析 找出特征序列 作为芯片设计的参照序列 数据库搜索 得到关于序列突变的信息及其它信息 cDNA芯片设计的关键在于数据库的建立和数据库信息 的利用以及各种文库的建立 11 3基因芯片的探针 Mouse cDNA Library 22
9、500 known genes ratio 2 0 Ratio 0 5 Step 6 结果有效性的证实 在表达矩阵上 有时难于区分极其相似的序列 如基因族成员 亚类或异类的存在 比较两种不同DNA序列表达水平时 有 些参数如核苷酸的成分 二级结构的存在和矩阵上DNA的长度 都会影响杂交 证实矩阵分析的结果可用RT PCR 区别基因族成员 比较不同 DNA种系表达 证实基因变异或突变和精确测定DNA表达水平 Northern Blot 证实某一基因的相对表达水平 Western Blot RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平 质谱仪 证实矩阵 结果是否在蛋白水平 等 11 7结果分析 数据处理 从
10、生物芯片的图像分析中取得了大量的 数据 这些数据是难以理解的 必须用专门的软件 从中提取有用信息 常用的处理方法主要是聚类分 析 包括系统聚类分析 hierarchical clustering 和逐 步聚类分析 K Means clustering 11 7结果分析 系统聚类分析是将芯片表达的数据点分配进入有 严格等级的层层嵌套的子集 最相接近的数据点 分成一簇 并用一个新点来替换 该新点的值为 此两点的平均值 其他点同样处理 然后用同样 的方法进行下级处理 直至最终成为一个点 这 样数据就形成一个家谱的树状结构 树枝的长度 表示两簇数据的相似程度 系统聚类分析适合于具有真正等级下传的数据结
11、 构 不适合于基因表达谱可能相似的复杂数据集 11 7结果分析 逐步聚类分析是按用户输入的k值将数据集随机的分成k簇 然后 a 计 算每簇的平均值 b 随机选择一个数据点 将此数据点加入平均值与 该点值最接近的簇 重新计算簇的平均值 重复上述2个步骤直至没 有数据改变簇时 计算结束 每次迭代过程中簇 的改变使簇内的变 异最小 簇间的变 异最大 这样使簇 不断地改进 使得 组间差异达到最大 值 逐步聚类分析适合 于分类相似基因 11 8基因芯片研究现状 现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究 和开发工作 而且已有较为成型的产品和设备问世 这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表
12、 产品 已有部分投放市场 产生的社会效益和经济效益令人 瞩目 用生物芯片进行药理遗传学和药理基因组学研究所涉 及的世界药物市场每年约1800亿美元 2010年仅美国用于基因组研究的芯片销售额达400亿 美元 这还不包括用于疾病预防及诊断及其他领域中 的基因芯片 11 8基因芯片研究现状 11 8基因芯片研究现状 11 8基因芯片研究现状 我国生物芯片研究始于1997年 在上海和北京建立了 2个生物芯片国家工程研究中心 目前 我国已有500余种生物芯片及相关产品问世 多个芯片产品获得了不同形式的新药及医疗器械证书 10余个芯片产品实现产业化生产 2005年实现销售 额近2 5亿元 部分产品已经进
13、入国际市场 我国生物芯片企业不少于50家 70 80 的生物芯片还 只是用于研发 离完全商业化还有一段不短的距离 由于研发成本高 产品价格也较高 11 8基因芯片研究现状 11 9基因芯片应用 基因功能分析研究 检测与疾病相关的基因 进而用于疾病诊断 药物筛选 检测基因突变 其他 环境化学毒物的筛选 体质医学的研究 11 9基因芯片应用 基因功能分析研究 将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上 对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分 化阶段不同病变不同刺激 包括不同诱导不同治疗手段 下细 胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测 从而对这些基 因表达的个体特异
14、性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异 性 进行综合评定与判断 极大加快这些基因功能的确立 检测与疾病相关的基因 进而用于疾病诊断 目前主要 涉及 癌症 心血管疾病 血液病 遗传性疾病 神经系统疾病 部分感染性疾病 免疫反应相关性疾病 毒物引起的损伤等 11 9基因芯片应用 11 9基因芯片应用 药物筛选 在基因功能研究基础上 特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变 化情况后 就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作 将这些基因特 异性片段固定在芯片上 研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下 这些基因表达的变化 可快速判断药物作用的效果 并进行高通量筛 选 high throughout scre
15、ening 可使新药开发获得技术上的突破 Evanse and Relling Science 1999 286 487 基因芯片可以帮助中医药走向世界 中药中众多成分中 有效成分的筛选 有效药物的筛选 中药毒理学过程均 被大大简化 将推动中药的迅猛发展 中药学引入基因 芯片技术 将大大推动中药研究的国际化进程 为阐明 中药作用机理 具有无可估量的重要意义 研究天然药物对人体的作用机制 筛选对人体有生物效应的单味天然药物 筛选对人体有生物效应的有效成分 筛选对人体有生物效应的天然药物配方 11 9基因芯片应用 进一步提高探针阵列的集成度 如有多家公司的芯片阵 列的集成度已达1 0 105左右
16、这样基因数量在1 0 105以 下的生物体 大多数生物体 的基因表达情况只用一块 芯片即可包括 提高检测的灵敏度和特异性 如检测系统的优化组合和 采用高灵敏度的荧光标志 多重检测以提高特异性 减 少假阳性 高自动化 方法趋于标准化 简单化 成本降低 价格 高昂是目前推广应用的主要障碍之一 但随着技术的革 新 基因芯片的价格将会大大降低 11 10基因芯片的发展方向 高稳定性 寡核苷酸探针 RNA均不稳定 易受破坏 而肽 核酸 PNA 有望取代普通RNA DNA探针 可以确保探针 的高稳定性 研制新的应用芯片 如美国环保局 EPA 组织专家研讨会 讨论了毒理学芯片的发展策略 近来多种新的生物芯片不断 问世 这是物理学 生物学与计算机科学共同的结晶 研制芯片新检测系统和分析软件 以充分利用生物信息 芯片技术将与其它技术结合使用 如PCR芯片 纳米芯片等 不同生物芯片间综合应用 如蛋白质芯片与基因芯片间相互 作用等 可用于了解蛋白质与基因间相互作用的关系 11 10基因芯片的发展方向 小结 基因芯片的实验体系 对照 样品 测试 样品 RNA 核酸提取 cDNA 核酸标记 提纯 芯片杂交 靶分
