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1、1水通道蛋白作者：石向群,杨金升, 汪泳,包仕尧 【关键词】 水通道蛋白 【Abstract】 AIM：To examine the distribution of AQP4 in normal rat spinal cord so as to provide theoretical basis for further study on its physiologic function. METHODS: Immunohistochemical staining with antiAQp4 monoclonal antibody was performed on spinal tissue f
2、rozen sections from healthy adult SD rats. RESULTS: The positive staining cells mostly included ependymal cells of myelocoele, glial cells, motor neurons, and epithelial cells of spinal pia mater. The staining was mainly located on the cell membrane. Most importantly, it displayed certain directivit
3、y in the glial cells, mainly at the membrane side contacting with capillary endothelial cells. CONCLUSION: AQP4 is widely expressed in rat spinal cord. In the glial cells, it is mainly located at the membrane side contacting with capillary endothelial cells, which are associated with bloodbrain barr
4、ier, suggesting that AQP4 may be involved in spinal water metabolism. 【Keywords】 Aquaporin4; distribution; rat; spinal cord 2【摘要】 目的： 明确正常大鼠脊髓内水通道蛋白4（AQP4）的表达与分布，为进一步研究其生理功能提供理论依据. 方法： 采用 AQP4 mAb，对正常 SD 大鼠脊髓的冰冻切片进行免疫组织化学染色,检测 AQP4 蛋白的表达水平. 结果： 免疫组织化学染色结果显示阳性着色细胞包括有胶质细胞、中央管室管膜上皮细胞、脊髓前角运动神经元、软脊膜上皮细胞，
5、着色部位主要在细胞膜，其中在胶质细胞表现出一定的方向性,主要分布在与毛细血管内皮细胞接触的一侧. 结论： AQP4 在正常大鼠脊髓内具有广泛的表达，在胶质细胞上其表达分布于与血脑屏障相关的毛细血管内皮细胞的一侧. 其表达的解剖分布提示 AQP4 在脊髓内主要参与中央管内水代谢以及神经组织间的水代谢调节. 【关键词】 水通道蛋白 4；分布；大鼠；脊髓 0 引言 1988 年第一个水通道蛋白（Aquaporin, AQP）被发现，1997 年被正式认可命名，从而为极性水分子透过以脂质双分子层为特征的细胞膜提供了分子结构依据1. 目前已发现的水通道蛋白有 11 种，它们广泛分布于各种生命体中，参与介
6、导调节水分子的跨膜转运. 研究发现水通道蛋白功能障碍已成为某些水代谢障碍疾病的中心环节2. 脊髓水肿是脊柱、脊髓损伤后的主要并发症之一，而且影响脊髓功能的恢复3 ，但目前尚缺乏对 AQP4 在脊髓组织中的分布以及生理功能的探讨. 我们采用免疫组织化学探讨AQP4 在 SD 大鼠脊髓内的分布特点，依据结构与功能相一致的原3则，推测其在脊髓内可能的生理功能，为脊髓内水代谢的调节和脊髓水肿的防治研究提供理论依据和新的思路. 1 材料和方法 1.1 材料 健康成年 SD 大鼠 6 只, 体质量(30025) g，雌雄各半，由苏州大学实验动物中心提供. AQP4 兔抗大鼠 mAb 购于深圳达科为生物技术
7、公司（美国 ADI 公司的产品） ，其抗原决定簇为 AQP4 C 端的 17 个氨基酸. 浓缩型抗兔 SP 免疫组织化学检测试剂盒及 DAB浓缩显色液购于华美生物工程公司. 1.2 方法 1.2.1 标本采集给予大鼠 36 g/L 水合氯醛 5 mL 过度麻醉后经心脏快速灌注冰生理盐水 300 mL，随后经心脏灌注 40 g/L 多聚甲醛 PBS（pH 7.3）300 mL,先快后慢，灌注固定后经后正中切口、咬除脊突和椎弓根，取颈、胸、腰段脊髓各一小段，将大鼠脊髓置入相同固定液中后固定 24 h. 1.2.2 冰冻切片取经后固定处理好的大鼠各部分脊髓，长约 5 mm，置入 200 g/L 蔗糖
8、中，至组织块沉底后置入 300 g/L 蔗糖中过夜，随后经 OCT 包埋、快速冰冻，恒冷箱切片机切片、片厚 18 m，裱于经防脱片处理的清洁载玻片上，-70保存待用于免疫组织化学检测. 1.2.3 免疫组织化学检测按免疫组织化学常规步骤进行. 取-70冰冻保存的切片，-20缓冲 30 min 后置室温晾干，PBS 漂洗4210 min，滴加 20 mL/L H2O2 于组织切片上，室温孵育切片 10 min；PBS 漂洗 310 min，滴加 10 g/L BSA/PBS 于切片上，置切片于盛有少量 PBS 的湿盒内 37 20 min；弃去组织切片上的液体, 擦干组织切片周围的载玻片，滴加兔
9、抗大鼠 AQP4 mAb 于组织切片上，置切片于盛有少量 PBS 的湿盒内，4 过夜；PBS 漂洗310 min，每切片滴加约 50 L 试剂盒中的生物素化二抗，37湿盒中孵育 60 min；PBS 漂洗 310 min，每切片滴加约 50 L 酶标链亲素，37湿盒中孵育 30 min；PBS 漂洗 310 min，DAB显色液显色，镜下观察，待显色合适后以 PBS 清洗终止显色反应. 滴加 10 g/L 苏木素 复染 1 min，流水漂洗 5 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、树脂胶封片. 光镜观察结果. 2 结果 脊髓内 AQP4 阳性细胞见于：脊髓中央管室管膜上皮细胞呈强阳性表达，尤其细
10、胞膜上更加明显（Fig 1）. 脊髓前角运动神经元也有明显阳性着色，同样也是以细胞膜着色为主，其间的胶质细胞也表现阳性着色（Fig 2）. 脊髓白质内的胶质细胞、脊髓表面软脊膜上皮细胞，其中细胞的着色也主要在细胞膜上，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得更加突出（Fig 3）. 胶质细胞和中央管室管膜上皮细胞着色具有一定的极性分布现象，前者主要分布于与毛细血管接触的一端，后者主要分布在靠中央管的顶端. 上述分布现象在脊髓不同节段无明显差异. 3 讨论 5从我们所发现的 AQP4 在脊髓中的分布情况，结合 AQP4 在脑内分布的相关文献4 ，可发现 AQP4 在脊髓中的空间分布
11、特点主要有： 主要分布于参与脑脊液的形成与吸收的相关结构，中央管室管膜上皮细胞、软脊膜上皮细胞； 分布于参与血脑屏障形成的相关结构，胶质细胞； 分布于对细胞外间隙 K+浓度敏感的神经元细胞. 我们发现 AQP4 在胶质细胞和中央管室管膜上皮细胞上的分布表现出明显的极性现象，即 AQP4 主要分布于面向毛细血管内皮细胞、软脑膜和中央管室管膜一侧的细胞膜或足突上，以及中央管室管膜上皮细胞的顶端. 已有的研究资料5,6 显示胶质细胞膜上钾离子通道的分布与 AQP4 在胶质细胞上的分布很相似，也具有相同的极性分布现象. 复习对 K+转运的相关研究结果发现：胶质细胞在调节维持细胞外间隙 K+浓度的恒定扮
12、演着重要作用，因为神经元兴奋将导致细胞外间隙 K+浓度的升高，但升高的 K+将被主要集中在胶质细胞的足突膜上 K+通道所分流； K+的有效清除对维持神经细胞处于正常功能状态是必不可少的. 但 K+的流动必将伴随水分子的流动，以代偿因 K+流动所引起的渗透压的变化. 分布于面向毛细血管内皮细胞和软脑、脊膜侧的胶质细胞和前角运动神经元细胞膜上的 AQP4 在组织解剖分布上与 K+通道相一致，由此支持 AQP4 在功能上参与维持调节细胞外 K+、水的代谢的生理功能的推测. 我们发现 AQP4 在脊髓中央管室管膜上皮细胞的表达水平很高，而且阳性着色主要分布在上皮细胞的顶端，对于这种分布的生理意义，我们
13、做如下推测：6分布于脊髓中央管室管膜上皮细胞的 AQP4 的主要生理功能是参与脊髓中央管脑脊液的形成和重吸收. 因为脑脊液形成的开始时期即由脑脉络丛上皮细胞分泌出相对高渗透压的脑脊液进入脑室，随后通过脑室管膜上皮细胞分泌水分以缓冲脉络丛上皮细胞分泌的高渗透压盐液，达到最终形成等渗的脑脊液7. Yamamoto 等8使用蛋白激酶 C 活化剂 TPA 处理培养的胶质细胞，可明显降低AQP4, AQP9 基因和蛋白的表达水平，而且发现这一效应可以被蛋白激酶 C 的抑制剂所逆转，但是蛋白质合成抑制剂并不改变 TPA 对胶质细胞 AQP4 的影响. 同时发现上述所有过程中对 AQP5 均不产生影响. 从
14、这一结果可以推测：细胞内的信号传导途径上的蛋白激酶 C 的活性变化可以直接影响细胞 AQP4 的表达水平及其活性；不同的 AQPs 的调节途径可能不同. AQP4 在细胞亚结构的定位发生变化时，同样可以导致其生物效应的变化. Kenichi 等9的研究结果显示 AQP4 的 C 端第 276280 的 5 个氨基酸对于 AQP4 固定在细胞膜上起着重要作用，它的突变或缺失均将导致 AQP4 不能正常定位在细胞膜上，从而进一步影响其生物学效应. 类似的研究结果10见于肌营养不良小鼠，因肌营养蛋白基因的缺陷导致肌营养蛋白功能缺陷，后者可以影响 AQP4 在胶质细胞和肌细胞膜上的正确定位，由此进一步
15、影响着 AQP4 生理功能的发挥. 此外AQP4 也会通过蛋白构像的变化而使活性发生改变11 . 【参考文献】 1 石向群, 王运良, 包仕尧. 水孔蛋白与缺血性脑水肿研7究进展J. 国外医学脑血管疾病分册， 2001；9 （4）：225-226. Shi XQ, Wang YL, Bao SY. The study progress of aquaporin and ischemic cerebral edema J. Foreign Med Sci Cerebrovasc Dis, 2001；9(4):225-226. 2 King LS, Yasui M, Agre P. Aquapor
16、ins in health and diseaseJ. Mol Med Today, 2000; 6(1):60-65. 3 陈百成，张为，张静，等. 6 羟基多巴胺和 MK801 对脊髓水肿抑制作用的实验研究J. 中华骨科杂志，2000；20 （ 8）：483-487. Chen BC, Zhang W, Zhang J, et al. An experimental study of the suppressive effect of 6OHDA and MK801 in spinal cord edema J. Chin J Orthop, 2000;20(8): 483-487. 4 Jung JS, Bhat RV, Preston GM, et al. Molecular characterization of an aquaporin cDNA from brain: Can
