《机械应力下成骨细胞外信号调节激酶ERK1-2的早期变化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《机械应力下成骨细胞外信号调节激酶ERK1-2的早期变化（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1机械应力下成骨细胞外信号调节激酶 ERK1/2 的早期变化作者：曹阳，郑翼，陈扬熙，罗颂椒 【摘要 】 目的： 观察体外培养的成骨样细胞在不同机械应力下细胞外信号调节激酶 ERK1/2 的表达变化. 方法： 采用四点弯曲细胞力学加载装置系统，对人成骨样细胞进行加力:频率 0.5 Hz，加力板变形量 4000 strain，按 5,15，30 min 和 1 h 不同时间段，使细胞发生单轴牵张和压缩应变. 运用 Western Blot 检测不同方向、不同作用时间的应力应变下细胞外信号调节激酶 ERK1/2 所产生的变化. 结果： 在 4000 strain 的周期性应力作用时，细胞外信号调节
2、激酶 ERK1/2 在 5 min 内被迅速激活，磷酸化程度大幅升高，牵张及压缩应力均有类似表现；1 h 左右恢复至基态水平. 牵张应力所引发的 ERK 磷酸化较压缩应力更强，其差异有统计学意义（P0.05）. 结论： 较大的应力应变可以在早期激活成骨细胞内的 MAPK/ERK 信号转导通路，牵张应力所产生的效应较压缩应力更为明显,机械应力参与了细胞外信号调节激酶的活化. 【关键词】 成骨细胞；机械应力；细胞外信号调节 MAP 激酶类；印迹法，蛋白质 【Abstract】AIM: To study the effect of mechanical strain on the expressio
3、n of ERK1/2 in osteoblastlike cells in 2vitro. METHODS: Osteoblastlike cells were cultured and then subjected to mechanical strain by selfmade fourpoint bending system at a 0.5 Hz frequency for 5, 15, 30 min, 1, 3, 6 h, respectively. In each timephase, the cells were loaded with tension and compress
4、ion stress at 4000 strain respectively. The phosphorylation levels of ERK1/2 were measured by Western Blot. Changes in the experiments were expressed as ratio to the controls. RESULTS: The selfmade fourpoint bending system supplied an accurate and effective cyclic uniaxial strain to the cultured adh
5、esion cells in vitro. 4000 strain tension stimulus and compress stimulus induced the expression of ERK in a few minutes and the effect of tension strain was more significant (P0.05). It may be due to the distinct mechanotransductive mechanism of the different directional mechanical strain. CONCLUSIO
6、N: Mechanical strain plays an important role in the activation of signaling pathway of MAPK/EPK in osteoblasts . The effect of tension strain is more significant than compress strain. Mechanical strain is involved in the activation of extracellular signal regulated kinase. 【Keywords】 osteoblasts; me
7、chanotransduction; extracellular signal regulated MAP kinases; Blotting, Western 30引言 细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase, ERKs)被认为是细胞对外界信号产生应答反应的一个上游枢纽，体外实验也已证实，机械力可以激活多种力学敏感型细胞，如内皮细胞1 、平滑肌细胞 2 、成骨细胞和破骨细胞 3-4 ，对细胞增殖、分化、功能、细胞周期及信号转导等多方面均有着重要的调控作用. 机械力对 ERKs 调控的研究少见报道. ERKs 活化是以其蛋白分子上氨基酸的磷
8、酸化为前提的，只有磷酸化的 ERK 才具有催化活性，所以本研究以同次电泳所得的蛋白条带 pERK/ERK 的比值作为比较和判断 ERKs 活性的依据，以此研究在不同机械应力下ERK1/2 的早期变化. 1材料和方法 1.1 材料 成骨样细胞株 MG63（ATCC 公司）培养试剂：DMEM 培养基（Gibco 公司） ，新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司）75 cm2 细胞培养瓶（No.353135, BD Falcon 公司） ，六孔细胞培养板（Coring 公司，美国） ，六孔板加力用离心支架（自制）离心机（LXJII 型，上海医用分析仪器厂） ，CO2 孵箱（Forma Scienti
9、fic.Inc.，美国） ，倒置相差显微镜及照相系统（OLYMPUS IX70） ，鼠抗人 pERK 多克隆抗体 （Santa Cruz） ；兔抗人 ERK1/2多克隆抗体 Santa Cruz） ；辣根过氧化酶 HRP 标记的兔抗鼠IgG（ Santa Cruz） ；辣根过氧化酶 HRP 标记的羊抗兔 IgG（Santa 4Cruz） ；洗脱液配置： 990 mL/L 巯基乙醇 684 L; 100 mL/L SDS 20 mL 1 moL TrisHCl PH 6.76 25 mL; 加双蒸水至 100 mL. 1.2 方法 1.2.1成骨样细胞株 MG63 的传代培养将成骨样细胞株MG6
10、3 按 1107/L 的密度，接种于经多聚赖氨酸处理的聚苯乙烯培养瓶中，加入含 100 mL/L 新生小牛血清的 DMEM 培养基，置于 CO2 孵箱（37, 50 mL/L CO2）. 当 MG63 细胞生长形成单层，铺满培养瓶底 80以上时，在无菌条件下传代 . 用DHanks 液清洗培养瓶 3 次，加入 25 g/L 胰酶2 g/L EDTA，室温消化 35 min, 1000 r/min 离心 5 min，弃上清液，加入含有100 mL/L 小牛血清的 DMEM 培养基，吹打细胞制成细胞悬液，按1107/L 密度分别置于各培养瓶中继续培养，隔天换液. 1.2.2四点弯曲加力装置对 MG
11、63 细胞的加力加力板准备: 将 BD Falcon 公司的 75 cm2 蓝盖斜颈细胞培养瓶从中间剖开，取细胞常规培养时用的底面（厚度 1.15 mm） ，分成 3 cm8 cm 大小的两块，周缘平滑四角圆钝，以避免加力过程中的应力集中. 洗净加力用细胞培养板，灭菌后接种细胞. 采用传代后的 MG63 细胞，胰酶消化离心后按 2105 密度接种于加力板上（试验组和对照组同时种板） ，然后将其放入培养皿中，贴壁 6 h 后加入含 100 mL/L 小牛血清的 DMEM 培养基，于 CO2 孵箱中培养 48 h 后，再5将培养基换为无血清的 DMEM 培养液继续培养 24 h，以同步化MG63
12、的细胞周期 . 采用 Forcel 四点弯曲体外细胞力学加载装置对接种在加力板上的人成骨样细胞进行加力，频率 0.5 Hz，加力板变形量为 4000 strain，按 5,15，30 min 和 1 h 不同时间段，使细胞在平行于贴壁方向上发生单轴牵张和压缩应变. 各加力组重复3 次（n 3 ） ，加力结束后分别收获细胞. 同时设定相应的对照组. 1.2.3Western Blot 冰 PBS 冲洗贴壁生长的细胞 3 次，2 mL/次；滴加少量 PBS 液（500 L）于培养板上，将细胞刮离培养板，收集入 EP 管内；按 15 的体积比将改良 RIPA 蛋白提取液，加入 EP 管中，混匀；冰上
13、裂解 30 min；4低温离心 30 min，1003 g，收集上清液；微孔板法进行微量蛋白定量测定（Bradford 法） ，计算各组浓度；将各组蛋白以 RIPA 液稀释为 1 g/L，然后加入同体积的上样缓冲液，煮沸 3 min，-20保存待用. 待胶凝固后将标准 10 孔加样梳取出后，移至电泳槽内加入甘氨酸电极缓冲液，每泳道加样 20 L（即 20 g 蛋白质） ；SDSPAGE电泳，分离样品蛋白质，80 V 恒压 1 h，120 V 恒压 1.5 h，电泳完毕后切胶：6.5 cm8.0 cm；用铅笔在预先裁好的 PVDF 膜左上角标记，甲醇处理 3 s 后放入双蒸水中水化 3 h；电转
14、缓冲液中浸泡3 mm 滤纸、凝胶及 PVDF 膜 5 h，由下到上以滤纸PVDF 膜 凝胶 滤纸的顺序移入电转仪内，排除所有气泡；Hoefer TE 70 半干电转仪（semidry transfer unit）65 mA 恒流电转 1.5 h，将蛋白质转移到 PVDF（Polyvinylidene Difluoride）膜上；根据蛋白6MARKER 指示的位置，将 PVDF 膜分成上下两部分，分别用于检测Mr103 为 65 的 NFB 和 42 的 Actin，获得最佳的内参照数据. 将 PVDF 膜放入封闭缓冲液室温摇床振荡 1 h，分别加入兔抗人NFB（p65）多抗及羊抗人 Actin
15、 多抗， 4杂交过夜；TTBS 漂洗 10 min3 次，对应上述不同的膜，分别加入二抗：HRP 标记的羊抗兔 IgG 及兔抗羊 IgG，37恒温杂交 1 h；TTBS 漂洗 10 min3 次，最后用不含 Tween20 的 TBS 漂洗 10 min：吹干PVDF 膜，将 Western Blot reagent A 液和 B 液按 11 比例混匀后，均匀地涂在其膜上 1 min；倒去发光试剂，在暗室内将 X 光片置于其上曝光 60 s 后放入暗盒 . 冲洗 X 光片，扫描并进行计算机图像分析. 将同次电泳所得的 NFB 及 Actin 条带灰度值相比，得到各样本组 NFB/Actin 的
16、灰度比值. 将同次电泳所得的 pERK 及ERK 条带灰度值相比，得到各样本组 pERK/ERK 的灰度比值. 统计学处理： Western Blot 实验结果以 xs 表示,采用SPSS 10.0 软件包，数据进行方差分析及 LSDt 检验. aP0.05认为差异有统计学意义. 2结果 当成骨样细胞（MG63 ）受到 4000 strain 的周期性应力作用时，ERK 在 5 min 内被迅速激活，磷酸化程度大幅升高，牵张及压缩应力均有类似表现（P0.01 ，图 1，表 1） ；随后 ERK 的磷酸化虽有一定程度回落但仍在高位持续一段时间（30 min 张应力组有小幅下降） ，1 h 左右恢复至基态水平. 组间比较（图 2）可见，75 min 时牵张应力所引发的 ERK 磷酸化较压缩应力更强，其差异有统计学意义（P0.
