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1、1氯沙坦通过减少细胞凋亡减轻心肌肥大大鼠的骨骼肌萎缩作者：付春景，黄幼田，郭龙辉，申琦，汤宁【关键词】 氯沙坦Losartan decreases skeletal muscle atrophy in rats with myocardial hypertrophy through reducing cell apoptosis【Abstract】 AIM: To explore the role of cell apoptosis in skeletal muscle atrophy in rats with myocardial hypertrophy and the effect of
2、losartan on it. METHODS: Fortytwo Sprague Dawley rats were randomly divided into 3 groups: group I (n=14, normal control group), group II (n=14, myocardial hypertrophy group) and group III (n=14, losartan group). Monocrotaline (30 mg/kg) was injected transperitoneally in group II and group III to in
3、duce myocardial hypertrophy. After 2 weeks, group III was treated with losartan 10 mg /(kgd) by gavage. After 2 additional weeks, the rats were killed. Gastrocnemius mass /body mass ratio served as the degree of muscle atrophy. 2Apoptotic cells in gastrocnemius were stained in situ by using TUNEL. G
4、astrocnemius Bcl2 and Bax protein were quantified by immunhistochemistry and Western Blot. Bax /bcl2 served as the degree of apoptosis. RESULTS: The ratio of apoptosis was higher in group II than that in group I （147.632.6）vs （4.11.8）, P0.05. The ratio of apoptosis was lower in group III than that i
5、n group II （46.212.3） vs （147.632.6）, P0.05. The atrophy of skeletal muscle in group II was more serious that in group I（P0.05 ）, but that in group III was less serious than that in group II. The expression of Bcl2 in group II was significantly lower than that in group I（P0.05）, but the expression o
6、f Bax in group II was significantly higher than that in group I（P0.05 ）. The expression of Bcl2 in group III was higher than that in group II（P0.05）but the expression of Bax was lower that in group II（P0.05 ） . The ratio of Bax/Bcl2 in group II was higher than that in group III. CONCLUSION: Cell apo
7、ptosis plays an important role in skeletal muscle atrophy in rats with myocardial hypertrophy and may be one of the factors causing skeletal muscle atrophy. Losarton can decrease skeletal muscle cell apoptosis and atrophy in myocardial hypertrophy rat through regulating the ratio of 3Bax / Bcl2.【Key
8、words】 apoptosis; myocardial hypertrophy; skeletual muscle; losartan【摘要】 目的：探讨细胞凋亡在心肌肥大大鼠骨骼肌萎缩中的作用及氯沙坦对心肌肥大大鼠骨骼肌萎缩的影响. 方法：雄性 SD大鼠 42 只随机分成 3 组(n=14)：组（对照组） ，组（心肌肥大组） ，组（心肌肥大氯沙坦治疗组）. 组和组分别一次性腹腔注射野百合碱（30 mg/kg）以诱导心肌肥大. 2 wk 后，组大鼠用氯沙坦10 mg/(kgd)灌胃. 再过 2 wk 后全部处死动物，以腓肠肌(GAS)的质量和体质量比作为骨骼肌萎缩的指标. TUNEL 法检测
9、 GAS 细胞凋亡 . 免疫组化和 Western Blot 法检测GAS Bcl2，Bax 的表达，并把 BaxBcl2 值作为凋亡的程度. 结果：与组比,组的 GAS 细胞凋亡率明显增加（147.632.6） vs （ 4.11.8）, P0.05 ，并且 GAS 出现了萎缩. 与组比，组的 GAS 细胞凋亡率明显减少（ 46.212.3） vs （147.632.6）, P0.05 ，GAS 萎缩减轻. Bcl2 的表达组比组明显减少（P0.05 ） ，Bax 的表达明显升高（P0.05）. 而组与组相比 Bcl2 的表达明显升高（P0.05 ）,Bax 的表达明显减少（P0.05 ）.
10、 组 GAS 的 BaxBcl2 值明显升高，而组 BaxBcl2 值明显下降. 结论：细胞凋亡在心肌肥大大鼠骨骼肌4萎缩中发挥着重要的作用，可能是骨骼肌萎缩的原因之一，氯沙坦可能通过改变 BaxBcl2 值减轻心肌肥大大鼠骨骼肌的凋亡和萎缩.【关键词】 细胞凋亡;心肌肥大;骨骼肌;氯沙坦0 引言心肌肥大患者的疲劳和气短,部分是由于骨骼肌的萎缩引起的,是耐疲劳的骨骼肌型纤维转变成易疲劳的型纤维. 在心力衰竭患者的骨骼肌中,已证实萎缩既不是骨骼肌缺乏锻炼也不是由于骨骼肌血液动力学的改变1,也不联系骨骼肌蛋白的合成 2. 我们的目的是通过复制心肌肥大大鼠的动物模型，来探讨细胞凋亡在心肌肥大大鼠骨骼
11、肌萎缩中的作用和凋亡易感基因 bcl2，bax 的变化及氯沙坦能否减轻心肌肥大大鼠骨骼肌的萎缩.1 材料和方法1.1 材料动物模型及分组：健康雄性 SD 大鼠 42 只，体质量180 200 g(购于河南省动物实验中心) ，随机分成 3 组（n=14）：组，正常对照组；组，心肌肥大组，腹腔一次性注射野百合碱530 mg/kg；组，氯沙坦治疗组，腹腔一次性注射野百合碱 30 mg/kg，2 wk 后用氯沙坦 10 mg/(kgd)灌胃( 上午 9:00空腹灌胃，1 次/d), 2 wk，组和组分别以等剂量的生理盐水灌胃. 试剂：TUNEL 法检测凋亡试剂盒为华美生物工程公司产品，鼠抗鼠 Bax
12、和 Bcl2 mAb 为 Santa Cruz 公司产品，免疫组化试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品.1.2 方法标本收集：在相同的条件下饲养 4 wk 后，用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉动物，开胸取出心脏，称量右心室壁(RV)质量，左心室加室间隔(LV+S)质量,体质量（BM）,并计算RV LV+S，RVBM，作为判断右心室肥大的指标. 称量腓肠肌(gastrocnemius, GAS)的质量，并计算 GASBM ，作为判断骨骼肌萎缩的指标. GAS 称量后，一部分经甲醛固定 48 h 后，石蜡包埋，切片备用做免疫组化，另一部分迅速放入液氮中保存备用做Western Blot. TU
13、NEL 法检测细胞凋亡：严格按照试剂盒的说明操作. 阴性对照以蒸馏水代替末端脱氧核糖核苷酸转移酶，阳性对照组先用 DNA 酶作用再行上述操作，镜下观察标记的阳性细胞. 免疫组化检测 Bcl2， Bax 的表达：切片常规脱蜡水化,一抗为鼠 Bax或 Bcl2 mAb(150稀释), 严格按照免疫组化试剂盒的说明书操作,以 PBS 代替一抗作阴性对照,DAB 显色,光镜观察阳性信号. 6Western Blot 检测 Bcl2, Bax 蛋白的表达：按参考文献3提取蛋白,总蛋白上样量为 100 g，120 g/L 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳后蛋白条带转移至硝酸纤维素膜, TBST 封闭后,特异性 mA
14、b 抗Bcl2(1500)或抗 Bax(1500)与硝纤膜杂交 4过夜, TBST 洗膜, 37以辣根酶标记的二抗与硝纤膜杂交, DAB 显色.统计学处理：采用 SPSS 10.0 版软件包进行统计学处理. 数据采用 xs 表示；Western Blot 结果采用 gelpro 图像分析软件进行分析，得出灰度值. 对各组作单因素方差分析，方差齐时用LSD(最小显著差异法). 方差不齐时用 Dunnets T3 法作各组间的多重比较，P0.05 表示差异有统计学意义.2 结果2.1 成功制作了心肌肥大大鼠模型野百合碱腹腔注射 4 wk 后，大鼠出现了明显的食欲减退、活动量减少等症状. 组较组的R
15、V LV+S 明显增大（ P0.05） ，RV BM 明显增大（P0.05） ，右心室出现了明显的肥大，说明心肌肥大的成功. 组与组相比 RVBM 降低（P0.05),但也有下降趋势 (表 1).表 1 大鼠的心室重塑指标和骨骼肌萎缩的指标（略）2.2GAS 的变化 组 GAS 富有弹性, 组 GAS 明显萎缩,变小,失7去弹性. GAS 的湿质量显示，GAS BM 组与组比有统计学差异（P0.05)，但是有明显的减轻 GAS 萎缩的趋势( 表 1).2.3TUNEL 检测凋亡的细胞核呈棕色，细胞核常位于肌纤维的中央或离开周边的细胞膜. 组鲜见凋亡的细胞核，而组发生凋亡的细胞核明显增多（P0.05 ） ，组也可见到凋亡的细胞核，和组比较有统计学意义（P0.05 ，表 2）.表 2 大鼠腓肠肌的细胞凋亡、Bcl2，Bax 表达的变化（略）2.4Bcl2，Bax 免疫组化组较组的 Bcl2 阳性率降低，提示 Bcl2 蛋白的表达明显下降（P0.05 ） ，而组与组相比，Bcl2 的阳性率升高，提示 Bcl2 蛋白的表达明显增加（ P0.05). Bax 的阳性率组较组增加，提示 Bax 蛋白的表达明显增加（ P0.05） ，而组与组相比 Bax 蛋白的表达明显下降（ P0.05） ，组
