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1、1果蝇 S2 细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定摘要 目的：构建果蝇 S2 细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法：用 PCR 方法扩增得到 pac 启动子的基因片段，经酶切亚克隆至pGL3Basic 的真核表达载体中，转染果蝇 S2 细胞，通过测定荧光素酶和 半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果：构建的重组质粒在 S2 细胞中荧光素酶的相对活性较 pGL3Control 中增加了 2.7 万倍。结论：成功构建了果蝇 S2 细胞中高表达荧光素酶的重组质粒 pGL3pac。 关键词 果蝇 S2 细胞；荧光素酶；启动子；报告基因；转染 在研究基因功能的过程中，不可避免地要研究基因的
2、调控机制，而基因的表达产物复杂且难以对其定量和定性，要在细胞生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难。但报告基因分析系统的发现给基因调控与表达的研究带来了新的希望。近年来，报告基因系统的研究取得了快速的发展。报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控，因此，对真核基因调控的了解可以不通过直接测定调控元件调节转录速率的能力，而是把顺式调控元件与报告基因的序列连接起来，在基因转录的过程中测定报告基因转录产物的表达量，从而判断相应的顺式作用元件的调控能力。作为报告基因必须具备以2下特点：（1）由原核基因编码的基因产物必须区别于转染前真核细胞内任
3、何相似的产物；（2）细胞内其他基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高、重复性好。该技术的主要优点是灵敏度高、可信性大及检测方便且适合大规模检测，目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件13。荧光素酶（LUC）报告基因来源于北美萤火虫，能催化萤火虫的氧化性羧化作用，同时发射出光子，可被光度计捕获定量。LUC 的分析具有快速、方便、线性较好等优点，正成为最广泛使用的报告基因。pGL3 系列的质粒就是带有 LUC 报告基因的质粒载体，我们可以利用这一系列的工具载体研究果蝇中基因的表达调控方式，其中pGL
4、3Control 带有 SV40 的启动子和增强子。 SV40 是一种猴病毒，它的增强子/启动子区域可使其在大多数细胞株中有高度的组成性表达，因而广泛用于构建真核基因的表达载体，因此 pGL3Control可作为检测体系中的阳性对照。但由于 SV40 启动子在果蝇 S2 细胞中不表达，所以我们将果蝇 actin 5C 蛋白的启动子（pac）4构建到质粒 pGL3Basic 中，得到了高表达 LUC 的重组载体 pGL3pac。这一质粒的构建可为研究果蝇中基因的调控方式奠定基础，同时也可为研究其他报告基因在不同细胞中的表达提供借鉴作用。1 材料和方法31.1 菌株、质粒及试剂大肠杆菌 DH5（作
5、者所在实验室保存） ，质粒 pGL3Basic(Promega 公司)，pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen 公司)，限制性内切酶Xho、Hind及 T4 连接酶、DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)，小量胶回收试剂盒(TaKaRa 公司)，中量质粒抽提试剂盒 (Invitrogen 公司)， LUC 检测试剂盒 (Promega 公司)，S2 细胞 Schneider 培养基(Invitrogen 公司)，胎牛血清（Gibco 公司） 。12 方法1.2.1 pac 启动子的获得 以 pAc5.1/V5His/LacZ 质粒为模板进行 PCR 扩增。上游引物5GCGCCT
6、CGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3,下游引物5GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3（划线部分分别为 Xho和 Hind 酶切位点） 。PCR 反应参数为： 95 5 min；94 1 min，60 1 min，72 2 min，共 30 个循环； 72 延伸 10 min。1.2.2 重组质粒的构建鉴定与中量抽提纯化 PCR 产物分别经Xho、Hind双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切片段，与同样经酶切、割胶回收的 pGL3Basic 质粒于 16 连接过夜，连接产物转化大肠杆菌 DH5，并涂布于含氨苄青霉素（终质量浓度4为 50 mg
7、L-1）的固体培养基上，37 过夜培养。挑阳性克隆提取质粒，酶切和测序鉴定，鉴定正确的质粒经中量质粒抽提试剂盒提取纯化。1.2.3 S2 细胞培养及瞬时转染 S2 细胞由本实验室冻存，使用Schneider 培养基，补以 10%胎牛血清。S2 细胞培养在 28 无CO2 培养箱中，根据其生长状态，按一定比例每 3 d 传代 1 次。待细胞生长状态良好时进行瞬时转染分析。转染时在 12 孔板中接种1106 个细胞，加入 1 ml 含 10%胎牛血清的 Schneider 培养基，置 28 无 CO2 培养箱中培养 616 h细胞生长至对数生长期达（24）106ml-1，在 1.5 ml Eppe
8、ndorf 管中准备以下试剂：溶液 A,12 l 2 molL-1 CaCl2，5 g 重组质粒,1 g pAcLacZ 质粒，加入双蒸水至总体积为 100 l，混匀待用；溶液B,100 l2HBS。将 A 溶液缓慢加入 B 溶液中，轻轻混匀，室温放置 30 min，以形成 Ca3PO4DNA 复合物。将 Ca3PO4DNA 复合物逐滴加至细胞上，混匀后置 28 无 CO2 培养箱中继续培养，24 h 后用含 10%胎牛血清的 Schneider 培养基给细胞换液。细胞转染48 h 后裂解细胞，先吸去培养液，用 PBS 洗 2 遍，在每个培养孔中加入 200 l Reporter lysis
9、buffer，保证充分覆盖细胞，冻融 1次以确保细胞裂解，将细胞裂解液移至 1.5 ml Eppendorf 管中，振荡 1015 s，离心（12 000g，2 min，4 ） ，转移上清于新管。制备好的细胞裂解液可用于测定或贮存于-70 备用。51.2.4 LUC 和 半乳糖苷酶 (gal)活性测定 取制备好的细胞裂解液进行 LUC 和 gal 活性的测定。LUC 活性测定前取 20 l 平衡至室温的细胞裂解液，加入 80 l LUC 底物，迅速混匀，置光度计中，记录读数。gal 活性测定根据分子克隆的方法，在每个用于测定转染细胞裂解物的 Eppendorf 管中加入 100Mg2+ 3 l
10、、1ONPG 66 l、细胞裂解物 30 l、0.1 molL-1Na3PO4 201 l,混匀。置 37 保温 30 min，以 500 l 1 molL-1 Na2CO3 终止显色反应。置酶标仪上，在波长 420 nm 处读光吸收值来表示 gal 的活性，以共转化的 gal 活性作为内源对照，以/gal 活性的值为系数，比较各组在转化效率相同时 LUC 活性的相互关系。以没有任何插入片段时 pGL3Basic 的 LUC 活性为 1，比较加上插入片段 pac 启动子后的 LUC 活性增加的倍数，即 LUC 的相对活性，以反映 LUC 基因表达的相对水平。2 结 果2.1 重组载体的构建鉴定
11、与纯化以 pAc5.1/V5His/LacZ 质粒为模板，通过上游引物和下游引物 PCR 扩增获得 pac 启动子 2 500 bp 基因片段（图 1） ，用 Xho、Hind双酶切后克隆到载体pGL3Basic 中（图 2） 。提取重组阳性质粒，Xho、Hind双酶切后得到 2 500 bp 的基因片段（图 1） 。经测序鉴定，阅读框架不变。鉴定完成的重组质粒经过质粒中量抽提试剂盒提取纯化，得到6符合转染所需的高纯度高浓度的重组质粒 pGL3pac，经测定其 260 nm 的 OD 值，计算得到其浓度为 0.99 gl-1,A260 nm/A280 nm 为 1.81。2.2 S2 细胞的瞬
12、时转染分析转染结果显示， pGL3Basic 和pGL3Control 中 LUC 的相对活性无明显差异，提示 SV40 启动子在果蝇 S2 细胞中不表达或低表达。而 pGL3pac 中插入了 pac 启动子，LUC 的相对活性明显增高。pGL3pac 在果蝇 S2 细胞中 LUC 的活性是 pGL3Basic LUC 活性的近 2.7 万倍。见表 1。表 1 瞬时转染后各组分酶活性值 3 讨 论LUC 是现在常用的一种报告基因,因其无放射性、检测快、灵敏度高、半衰期短、线性好等特点而得到广泛的应用。我们构建了pGL3pac 这一重组质粒，使得在果蝇 S2 细胞中能够高表达 LUC，为进一步的
13、实验提供了一个好的工具。首先，它可作为基因启动子分析研究中的阳性对照,通过与该重组质粒的转染结果比较,从而判定不同顺式作用元件对转录的影响。其次，我们可以将目的基因某一区域的启动子元件插入到重组质粒 pGL3pac 启动子的上游或下游，通过 LUC 表达量改变的放大作用，进一步分析这些启动子元件的生物学作用，找到在转录过程中起到关键作用的核心启动子序列。在7此基础上，我们还可以了解特定的反式作用因子对基因表达的影响。再次，还可以将目的基因自身的 5端或 3端的 UTR 序列插入到LUC 基因的上下游，通过检测 LUC 的水平，为翻译水平的调控提供依据。在实验过程中，有很多方面值得我们注意。第一
14、，在重组质粒利用中量试剂盒抽提纯化时，想得到浓度高的产物，应注意在菌液的培养量和培养时间上进行调整。因实际环境的不同，按照操作说明所示的条件往往难以得到足够的质粒量，通过增加培养的菌液量和延长培养时间可取得很好的效果。由于所得的质粒是细胞转染所需，故在抽提纯化时应特别强调无菌的原则。第二，在转染实验中，重组质粒 pGL3pac 必须共同转染表达另外一带有报告基因的质粒以衡量转染效率。我们选择了 pAcLacZ，该质粒含 lacZ 基因，能够表达 gal，利用 gal 水解底物 ONPG 的能力计算出 gal 的活性，以此作为内源对照衡量不同组分的转染效率。这个质粒与目的质粒的转染比例对于结果有
15、很大的影响。因 gal 的活性在0.20.8 之间符合线性范围,所以可根据这一要求摸索合适的转染比例，通过实验可得出两者在 51 浓度比时较合适。另外，还可以选择带有其它报告基因的质粒载体，如 phRL 是一种带有海肾荧光素酶（RLUC）报告基因的质粒载体，如果选择 phRL 作为共转质粒则可通过在一管细胞裂解液中先后加入不同的底物，用同种仪器测定酶的活性即可，因其测定的两种酶的活性在同一数量级而且减少实验步骤，使实验数据更加可靠，实验过程更加简便5。第三，我们是通过瞬时转染得出结论，为排除一些因素的影响，转染实验必须8重复 3 或 4 次，本实验的转染数据即是 3 次实验的平均值。在实验中我
16、们选择了 pac 替代 pGL3Control 中的 SV40 启动子，主要是因为果蝇 actin 5C 蛋白组在果蝇体内为组成性表达且不需诱导，因此，利用 pac 作为替换启动子，不仅能产生较好的效果而且可简化实验操作。这一质粒的构建不仅为我们在细胞水平利用报告基因系统研究果蝇中基因的表达调控方式提供工具载体，而且它的构建方法提示我们可通过相同的途径构建适合转染不同类型细胞的带有报告基因的质粒载体，作为相应研究的基础。参考文献1LOUISE H. Reporter gene technology：the future looks bright J.Biochem Pharmacol,1999,58:749757.2GAMBHIR S S，BARRIO J R，HERSCHMAN H R，et al. Assays f
