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1、1氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用观察【摘要 】 目的观察氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用。 方法以国人骨肉瘤细胞株 OS-732 细胞为研究对象，根据析因试验设计原因，设 1 无药组（阴性对照组） ，2 咖啡因组，3 氨甲喋呤组，4 咖啡因、氨甲喋呤联合用药组（混合用药组） 。培养一段时间后，分别采用 MTT 法细胞毒性试验和流式细胞仪（FCM）分析，观察 3 组药物对细胞的毒性（用残存细胞吸光度 A 值表示）及细胞周期的影响。 结果FCM 分析各组于 48 h G2/M 期细胞比例（%）为 1 组（23.2100.416） ，2 组为（23.1200.440） ，3 组为（28
2、.7700.531） ，4 组（23.2670.319） ，1 组与 2 组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义（P0.01） 。各组残存细胞吸光度 A 值为 1 组（0.4110.006） ，2 组（0.4010.006 ） ；3 组（0.3040.007） ，4 组（0.1050.002） ，组间差异及交互作用有统计学意义（P0.01)。 结论氨甲喋呤与咖啡因具有协同作用，可增加氨甲喋呤对骨肉瘤细胞株的抑制率。 【关键词】 骨肉瘤； 氨甲喋呤； 咖啡因； 肿瘤细胞,培养的AbstractObjectiveTo observe whether or not caffeine can
3、 improve the cyto-toxicity effect of methotrexate (MTX) 2on osteosarcoma cell line.MethodOsteosarcoma cell(OS-732)were incubated with no drug,caffeine,MTX or MTX adding caffeine separately,and were named as control group,caffeine group,MTX group and mixing group respectively.The ratios of cells on G
4、2M phase of each group were measured with flow cytometry after 48 h incubation and the cell inhibition ratios were measured with the MTT colorimetric analysis after 72 h incubation.ResultThe ratios(%)of cells on G2M phase were control group（23.2100.416),caffeine group（23.1200.440),MTX group（28.7700.
5、531）and mixing group（0.1050.002）(P 0.01,except control group between caffeine group),the absorbency of survival cell(A value)were control group（0.4110.006),caffeine group（0.4010.006 ） ；MTX group（0.3040.007）and mixing group（0.1050.002）(P 0.01).Conclusion Caffeine can improve the cyto-toxicity effect
6、of MTX on osteosarcoma cell line.Key words：osteosarcoma; MTX; caffeine; tumor cell,incubation肿瘤细胞在化疗药物作用后,有的会出现细胞周期受阻的现象，3包括 G1 停滞，S 期蓄积， G2M 期阻滞等。G2M 期阻滞被认为是细胞的一种保护性调节，可以使 DNA 受损的细胞获得充分的修复时间，从而顺利地进入下一个细胞周期，避免被诱导凋亡。咖啡因是近年来发现的肿瘤化疗增加剂，主要作用机理是缩短 G2M 期阻滞。氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后会不会出现 G2M 期阻滞，加入咖啡因能否增加其细胞毒性，目前尚缺乏试验
7、依据。1 材料与方法1.1 材 料OS-732 细胞株购于北京积水潭医院创伤骨科研究所，RPMI 1640 干粉及胰酶购于美国 Cibco 公司，氨甲喋呤购于浙江万马药业有限公司，咖啡因购于美国 Sigma 公司，FCM 美国 Coulter 公司生产，酶联免疫检测仪美国 Coda 公司生产， CO2 孵箱 Sheldon Manufacturing 公司生产，倒置显微镜重庆光学仪器厂生产，96孔培养板 Nunclon International 公司生产。1.2 方 法1.2.1 细胞培养4细胞常规培养于体积分数为 10%新生小牛血清（经 56 30 min 水浴灭活）的 RPMI 1640
8、 培养液中，其中含有青霉素 100 IU/ml 及链霉素 100 g/ml，在 37 体积分数为 5%CO2、95%空气、饱和湿度的 CO2 孵箱内闭式培养。取传代后第 3 d 处于指数增殖期的细胞备用。1.2.2 细胞处理取生长良好的细胞，以少量胰蛋白酶将贴壁细胞消化、离心，倒去上清液，加入适量 RPMI 1640 培养液，用吸管反复吹打均匀制成细胞悬液。根据析因试验设计原理将细胞株分为 4 组，1 组无药组（阴性对照组） ；2 组咖啡因组，培养液内加入咖啡因，浓度为5.0 mmol/L；3 组氨甲喋呤组，培养液内加入氨甲喋呤，浓度为320 g/ml；4 组混合用药组，培养液内同时加入浓度为
9、 5.0 mmol/L 的咖啡因与浓度为 320 g/ml 的氨甲喋呤。同时调整细胞浓度为 2105/ml。各组细胞加入 96 孔培养板，每组设 3 复孔，每孔 200 l。置 37 体积分数为 5%CO2、95%空气、饱和湿度的 CO2 孵箱内闭式培养，供测量各组药物的细胞抑剂率。同时各组取相同浓度的细胞悬液 10 ml 于培养瓶中在 37 体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的 CO2 孵箱内闭式培养供观察G2M 期比例。51.2.3 流式细胞仪（FCM）对细胞周期进行分析将置于培养瓶内的各组细胞于 48 h 取出，以 0.25%胰蛋白酶消化 35 min，至贴壁细胞间出现筛状间隙为
10、止。弃去消化液，加Hanks 液。用吸管将细胞自瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。短时低速离心（1 000 r/min，5 min)。弃上清，加冷PBS（pH 7.4)，均匀吹打，并短时低速离心 3 次（1 000r/min,5 min)以去除悬液中的细胞碎片。再次加入冷 PBS（pH 7.4)均匀吹打，制成单细胞悬液。将细胞液以 500 目尼龙网过滤，以去除重叠成团的细胞。调整细胞浓度为 1104/ml。在 4 冰箱内进行荧光染色后用流式细胞检测 G2M 期细胞百分比。每组细胞测 3 次，用SPSS 12.0 统计软件，对结果进行方差分析。1.2.4 MTT 法测定各组细胞的 A 值及抑制
11、率72 h 后将 96 孔板取出，每孔再加 12 稀释的 MTT 应用液（5 mg/ml)20 l,继续培养 4 h 后弃除上清液，于每孔中加入 10%的二甲亚砜 10 l，振荡 5 min，直到结晶完全溶解，液体呈蓝紫色，然后在酶联免疫检测仪上以 570 nm 波长测定吸光度（A ）值。并可根据 A 值计算出各组的细胞抑制率。用 SPSS 12.0 统计软件，对结果进行方差分析，观察各组间的差异及药物间交互作用是否具有统计学意义。62 结 果2.1 FCM 分析各组 48 h G2M 期细胞所占比例（表 1）1 组与 2 组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义（P 0.01） 。单
12、独应用 5.0 mmol/L 的咖啡因对 G2M 期无明显影响，单独应用氨甲喋呤时出现 G2M 细胞比例增高，二者联合应用后 G2M 期细胞比例降低。表 1 各组 48 h G2M 期细胞所占比例（略）2.2 MTT 法测定各组细胞 72 h A 值（表 2）各组间差异具有统计学意义（P0.01） 。单独应用 5.0 mmol/L的咖啡因对骨肉瘤细胞有轻微影响，320 g/ml 的氨甲喋呤对骨肉瘤细胞有较大抑制作用，二者联合应用后可明显减少 A 值，对肿瘤细胞抑制作用最明显。根据统计分析二者联合具有交互作用，差异有统计学意义（P0.01） 。表 2 MTT 法测定各组细胞的 A 值（略）3 讨
13、 论新辅助化疗的开展及新的细胞毒性药物的使用使包括骨肉瘤在内7的许多肿瘤治疗有了明显改观1 ，尽管如此，肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药性仍是造成化疗失败的主要原因。传统上对肿瘤耐药及逆转剂的研究主要集中在细胞膜/核膜蛋白，即药物输出泵：如P 糖蛋白（Pgp） 、多药耐药相关蛋白（ MRP）和肺耐药相关蛋白（LRP） 。已有的逆转剂大部分是针对细胞 P 糖蛋白（Pgp)，通过抑制 P 糖蛋白（Pgp)对进入细胞内化疗药物的外排作用，提高细胞内化疗药物的水平，来增加化疗药物的杀伤作用。如钙离子通道阻滞剂，环孢酶素 A 及其衍生物，抗激素类化合物等，但其效果仍欠理想。近年来研究表明，DNA 作为多种
14、抗癌药物攻击的靶分子，其损伤修复能力异常与肿瘤耐药性的形成有着密切关系。因此，从 DNA损伤修复的研究入手，将为肿瘤治疗和耐药性逆转开辟新的途径。周期运转中的细胞有一种识别 DNA 损伤的能力，一旦出现 DNA 损伤，细胞周期就会受阻，包括 G1 停滞、S 期蓄积和 G2M 期阻滞，从而给细胞修复提供足够的时间。细胞周期素(Cyclin)为重要的细胞周期蛋白的调控基因。目前发现的 Cyclin 有 Cyclin AH。Cyclin B 主要出现在 G2M 期2 。其表达的产物细胞周期蛋白与P34cdc2 蛋白复合物被称为有丝分裂促进因子(maturation promoting factor,
15、MPF)。在正常细胞，G2 后期 MPF 氨基酸被磷酸化或去磷酸化，从而具有激酶活性，进而诱导一系列底物(如核层蛋白，H1 组蛋白，核仁蛋白等) 磷酸化，引导核膜崩解，染色质凝8聚等有丝分裂所具有的变化。细胞通过抑制 cyclin B 表达，或抑制P34cdc2 激酶活性，使细胞不能进行有丝分裂，从而产生 G2M 期阻滞。Yao SL3等发现，咖啡因有活化受抑制的 MPF 的能力。因此可以缩短甚至取消 G2M 期阻滞，从而可以逆转肿瘤耐药。该原理在国外已经临床使用，并取得不错的临床效果4 。国内也开始对此进行研究。万双林5 等发现安全浓度的咖啡因在骨肉瘤细胞株(OS-732)顺铂热化疗中具有增
16、效作用，并发现咖啡因能促进经顺铂热化疗后的骨肉瘤细胞由 G2/M 期向 G0/G1 期移行，导致G2/M 期缩短，细胞不能进行足够的 DNA 修复而进入分裂期，从而加速细胞死亡。李钧等6 的研究表明，咖啡因有促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。目前在临床上使用更多的 Rosen T125化疗方案，其中氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后，是否出现 G2M 期阻滞，咖啡因能否缩短甚至取消 G2M 期阻滞，二者联合应用能否增加肿瘤细胞抑制率，尚未见报道。作者根据析因试验设计原因，设置 4 个实验组，用FCM 测定各组细胞于 48 h G2M 期比例，用 MTT 法来测定各组药物对肿瘤细胞作用 72 h 后残存细胞吸光度，结果显示，单纯应用5.0 mmol/L 咖啡因，对肿瘤细胞 G2M 期比例无明显影响，对肿瘤细胞有轻微抑制；单纯应用氨甲喋呤，增加 G2M 期比例，对肿瘤细胞有抑
