《气阴双补法对干燥综合征小鼠的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《气阴双补法对干燥综合征小鼠的实验研究（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1气阴双补法对干燥综合征小鼠的实验研究【摘要】 目的研究气阴双补法对干燥综合征小鼠的作用。方法将60 只 Bacb/C 小鼠，按体质量随机分为 6 组，每组 10 只，即正常组，模型组，羟氯喹组，增液布津汤小剂量组、中剂量组和大剂量组。对照组用羟氯喹片剂，观察体质量、摄食量、饮水量、唾液流量、脾指数及颌下腺病理形态学变化。结果增液布津汤能有效缓解口干、口腔烧灼感、眼干、眼异物感、鼻干等临床症状。实验室检查方面能增加唾液流量及泪流量，病理显示能抑制淋巴细胞浸润。结论运用气阴双补不仅能缓解干燥综合征小鼠临床症状，而且能纠正免疫紊乱,疗效优于对照组。 【关键词】 气阴双补； 干燥综合征； 小鼠Abs
2、tract：ObjectiveTo research the function of the method of nourishing both “qi” and blood on the mice having SS.MethodsPut the 60 Bacb/C mice into 6 groups according to their weight at random, there were 10 mice in each group.The groups included the normal group, the model group, the hydroxychloroquin
3、e group, the low, middle and high dose group using Zengye Bujin Decoction. We used hydroxychloroquine tablets on the mice in the control group 2and then observed the index weight, food intake, water intake, salivary flow rate, spleen index and the pathomorphology observation of submandibular gland.R
4、esultsZengye Bujin Decoction could effectively relieve dry mouth, burning mouth sensation, dry eye, eye foreign body sensation, dry nose and some other clinical symptoms. The examination of lab showed it could increase salivary flow rate and tear flow rate. Pathology also showed it could restrain th
5、e infiltration of lymphocyte.ConclusionThe use of the method of nourishing both “qi” and blood can not only relieve the clinical symptoms of the mice having SS, but also correct immunologic derangement, whose efficacy is better than those in the control group.Key words：Nourishing both “qi” and blood
6、 ； SS； Mice； Experimental research干燥综合征(Sjogrens syndrome，SS) 是一种侵犯外分泌腺体（尤以唾液腺和泪腺为主）的慢性自身免疫病。本病病因可能与遗传、免疫、性激素、内分泌和病毒感染等因素有关。中医学无此病名，根据其发病及临床特征，将之归属祖国医学“燥证” “燥痹”范畴。金元时期，刘河间在素问玄机原病式燥类中指出：“诸涩3枯涸，干则皴揭，皆属于燥” ；并创立麦门冬饮子以治之。明清以后，各家对燥证已论述颇多，均从不同角度对燥证进行了较系统的探讨和研究。最具代表性的是清代喻嘉言，认为除燥伤于外皮肤皴揭之外，燥伤于内而致的精血枯涸亦属于燥证范畴，
7、并根据刘河间“风热胜湿为燥”的理论提出了辛凉甘润法治疗燥证，代表方剂为著名的清燥救肺汤。然而，从临床研究发现，SS 除与阴虚燥毒有关外，与气虚因素密切相关，运用气阴双补法对干燥综合征小鼠实验研究，通过研究其对小鼠的干预作用，旨在为临床治疗提供确切依据。1 材料与仪器1.1 动物 12 周龄 Bacb/C 小鼠，60 只，1822 g，雌性，由南京青龙山实验动物中心提供。1.2 药品增液布津汤，由南京中医药大学药学院制剂研究室提供；硫酸羟氯喹（hydroxychloroquine ，HCQ） ，上海中西制药有限公司，批号：040501。1.3 试剂弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，SIGMA，USA
8、，Lot：075K8915 ；吸附无细胞百日咳、白喉、破伤4风联合疫苗，成都生物制品研究所，批号：200503171 。PBS 磷酸盐缓冲液，0.01M，pH7.27.4 ，中杉金桥，批号：ZLI9061；牛血清白蛋白，南京生兴生物技术有限公司，Amresco分装，Lot ： 1105S02；Mouse IFN ELISA KIT，晶美生物工程有限公司，Lot：FMK0003；Mouse IL4 ELISA KIT，晶美生物工程有限公司，Lot：FMK0005。1.4 仪器 FA2104 上皿电子天平，上海精科；XW80A 涡旋混合器，上海医科大学仪器厂；Eppendorf 5417R 高速低
9、温冷冻离心机；LDZ52 型离心机，北京医用离心机厂；FSHII 型高速电动匀浆器，江苏金坛振华仪器厂；TU1800S 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PYXDH540X50 隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；TEB 微量振荡器，姜堰市康泰医疗器械厂；BIORAD 3550 酶标仪，MICROPALTE READER。2 方法2.1 分组及给药 60 只 Bacb/C 小鼠，按体重随机分为 6 组，每组 10 只。临用前分别将上述药物用生理盐水配成以下浓度：正常组：生理盐水 10 ml/kg；模型组：生理盐水 10 ml/kg；羟氯喹组：0.1 g/kg；增液布津汤小
10、剂量组： 0.05 g/ kg；增液布津汤中剂量组：0.075 g/ kg；增液布津汤大剂量组：0.10 g/ kg。且小鼠5灌胃体积为 10 ml/kg。各组均在第 0 天即开始给药。2.2 抗原的制备取 8 只 Bacb/C 小鼠，脱颈椎处死，75%酒精浸泡 10 min，在无菌操作台上解剖颈部，取出两侧颌下腺，分离包膜及结缔组织，用氯化钠注射液洗净，置无菌滤纸上吸干，称重，用显微剪剪碎，每 0.1 g 置入 10 ml 无菌试管中，加氯化钠注射液2 ml，在冰浴中用匀浆器以 5 000 r/min 匀浆 20 s，4低温离心机中 3 000 r/min 离心 20 min，弃去上层脂质，
11、吸出上清液，置10 ml 无菌试管中，以上操作均在低温下进行。2.3 Lowry 法蛋白定量2.3.1 溶液配制溶液 A：0.5 g CuSO4H2O、1 g C4H4O6KNa4H2O 加重蒸水至 100 ml；溶液 B：2 g Na2CO3、 0.4 g NaOH 加重蒸水至 100 ml；溶液 C：1 ml 溶液A 加 50 ml 溶液 B，混匀；溶液 D：10 ml Folin 酚试剂加 10 ml重蒸水混匀。2.3.2 检测精密吸取样品溶液 1 ml，加入 5 ml 溶液 C，混匀，在室温下放置 10 min，加 0.5 ml 溶液 D，混匀，30 min 后以分光光度计测定吸光值，
12、检测波长为 650 nm。62.3.3 标准曲线的制备分别精密吸取 1.0 ml 系列对照品溶液于具塞试管中，以 1.0 ml 蒸馏水作空白对照，Lowry 法测定，用752 紫外可见分光光度计在 650 nm 波长处测定吸收度。以牛血清蛋白对照品浓度（C）为横坐标，吸收度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算蛋白含量。2.4 SS 小鼠模型的制备用灭菌 PBS 将抗原稀释成 800 g/ml，加等量弗氏完全佐剂，使抗原变为 400 g/ml的油水混合乳剂，第 0 天，模型组、羟氯喹组、大、中、小剂量组小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射 0.05 ml，即每只小鼠注射 0.1 ml 抗原。
13、第 14天，用弗氏不完全佐剂将抗原调整为 400 g/ml，小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射 0.05 ml。正常组小鼠注射 0.1 ml PBS 加佐剂。在第 2 天及第 7 天，各只小鼠腹腔注射 0.05 ml 白百破联合疫苗。2.5 检测指标2.5.1 小鼠体质量、摄食量、饮水量的测定每 2 天称小鼠体质量，每 2 天加饲料 100 g，加水 100 ml，2 d 后称量剩余饲料量及水量，投入的饲料量或水量分别减去剩余饲料量或剩余水量即为每 2 天每笼小鼠摄食量及饮水量。2.5.2 小鼠唾液流量的测定每周测定每只小鼠唾液流量，测7定前禁食 1 h，不禁水。测定前做好棉球称干重，重量范围4.5
14、5.0 mg。测唾液分泌时将已经称好干重的棉球放入实验小鼠口颊内，5 min 后取出，电子天平上称湿重。唾液分泌量（mg）湿重干重2.5.3 脾指数、颌下腺指数的测定于实验结束，小鼠眼眶取血后脱颈椎处死，取血，3 000 r/min 离心 10 min，取血清用于细胞因子测定。取脾及颌下腺称重。脾指数脾重量（g）小鼠体重（g ） 1 000颌下腺指数颌下腺重量（g）小鼠体重（ g）1 0002.5.4 小鼠外周血中 T 淋巴细胞亚群 检测小鼠眼眶取血后脱颈椎处死，取血，流式细胞仪检测 T 淋巴细胞亚群CD3，CD4，CD8。3 结果3.1 体质量正常组小鼠体质量稳定，缓慢增加，其他组均在第 1
15、 次免疫后 68 d 开始体重出现减轻，与正常组有显著性差异，模型组体质量持续下降，给药组体质量亦持续下降，但给药后小鼠8体质量维持在较稳定水平，羟氯喹、增液布津汤小、中、大剂量组分别在第 24，20，16 天与模型组比较出现显著性差异。结果见表1。表 1 增液布津汤对 SS 小鼠体质量的影响 (略)3.2 摄食量正常组小鼠摄食量在实验期间维持稳定，而接受抗原注射的小鼠摄食量减少，从第 6 天起较为明显，而增液布津汤对小鼠摄食量无影响，与模型组比较无差异。结果见表 2。表 2 增液布津汤 对 SS 小鼠摄食量的影响 (略)3.3 饮水量在实验初各组小鼠饮水量无差异，在接受抗原注射第 12 天后
16、小鼠饮水量出现明显增加，模型组小鼠饮水量持续上升直至实验末，而羟氯喹和中药能在一定程度上降低 SS 小鼠饮水量并维持在一定水平。结果见表 3。表 3 增液布津汤对 SS 小鼠饮水量的影响 (略)3.4 唾液流量在实验适应期及免疫后第 1 周各组小鼠唾液流量无差异，从第 2 周起，模型组小鼠唾液流量与正常组比较显著降低，并逐渐降低，而给予羟氯喹和中药后，能增加 SS 小鼠唾液流量，分别在第 4，3，2 周与模型组比较有显著性差异。结果见表 4。表4 增液布津汤对 SS 小鼠唾液流量的影响 (略)3.5 脾重、脾指数模型组小鼠脾重、脾指数与正常组比较均9显著增加，而给予药物后，均能显著降低 SS 小鼠的脾重、脾指数。结果见表 5。表 5 增液布津汤对 SS 小鼠脾重、脾指数的影响 (略)3.6 颌下腺重、颌下腺指数模型组小鼠颌下腺重、颌下腺指数与正常组比较均显著增加，而给予药物后，均能显著降低 SS 小鼠的颌下腺重
