《曲古菌素A和ATRA合用对PLZFRARα转基因阳性发病鼠骨髓细胞的诱导分化作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《曲古菌素A和ATRA合用对PLZFRARα转基因阳性发病鼠骨髓细胞的诱导分化作用（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1曲古菌素 A 和 ATRA 合用对 PLZFRAR 转基因阳性发病鼠骨髓细胞的诱导分化作用作者：陈思宇，董颖，陈丽娟，张龙，王龙，陈强，王振义 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of alltrans retinoic acid (ATRA) in combinetion with trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor, on PLZFRARpositive cells. METHODS: Molecular cloning technology was used to c
2、onstruct hCGPLZFRAR gene. HCGPLZFRAR transgenic mice were generated, in which PLZFRAR fusion gene was driven by hCG promoter to express in myeloid cells of mice. The genotype and phenotype were analyzed by PCR, Southern Blot, RTPCR, immunofluorescence, morphology of bone marrow cells, peripheral blo
3、od cells and spleen cells, pathology of bone, spleen and liver. Bone marrow leukemia cells were cultured in vitro. The change of cell morphology was observed by WrightGiemsa staining; cell cycle distribution and expression of cell membrane surface differentiationrelated antigens (such as CD11b, CD11
4、7 and Gr1) were determined by flow cytometry assay. Expression of PLZF was analyzed by immunofluorescence. Functional 2differentiation was reflected by nitroblue tetrazolium(NBT) reduction ability. RESULTS:Some hCG PLZFRAR transgenic mice developed leukemia resembling human chronic myeloid leukemia.
5、 After treated with TSA and RA, bone marrow leukemia cells presented morphologically some features of differentiated cells; the cell growth and proliferation were inhibited in a timedependent manner. The proportion of cells in S phage was decreased. The expression of PLZF relocated in treated cells.
6、 However, no significant difference in NBT assay was documented with the combination therapy. CONCLUSION: Combination of histone deacetylase inhibitor with ATRA can cause a partial differentiation of PLZFRAR positive cells. 【Keywords】 PLZF; RA; transgene; histone deacetylase; differentiation; leukem
7、ia, promyelocytic, acute 【摘要】 目的： 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A,TSA)和 ATRA 对 PLZFRAR转基因发病鼠骨髓细胞的作用. 方法： 分子克隆技术构建 hCGPLZFRAR转基因构件. 显微注射建立仅在髓系细胞中表达 PLZFRAR的转基因小鼠模型. DNAPCR，Southern blot，RTPCR ，免疫荧光，血象，骨髓象，脾细胞形态，病理等检测分析基因整合表达及发病情况. 取 PLZFRAR转基因发病鼠骨髓细胞体外培养，经 TSA 和 ATRA3作用一段时间后，WrightGiemsa 染色观察细胞形态，流
8、式细胞仪检测细胞周期、细胞表面分化抗原 CD11b 和 CD117 等的表达，荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达，硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况. 结果： TSA(30 g/L)联合 ATRA(1 mol/L)使发病鼠骨髓细胞核质比缩小，幼稚细胞比例减少，细胞生长增殖受抑，S 期细胞减少，PLZF 蛋白的表达呈局部聚集的趋势，但 NBF 还原试验变化尚不明显. 结论： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA 联合 ATRA 可使 PLZFRAR转基因发病鼠骨髓细胞发生部分分化. 【关键词】 PLZF；维甲酸；转基因；组蛋白去乙酰化酶；分化；白血病,早幼粒, 急性 0 引言 在诱导肿
9、瘤细胞分化方面，急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)为人们提供了一个理想的研究模型1. 约 95% APL 患者的白血病细胞中携带有非随机染色体易位t(15;17)(q22;q21)，形成 PMLRAR融合基因，成为 APL 特征性的分子标志. 少数变异型 APL 患者携带 t(11;17) (q23;q21)，表达PLZFRAR融合蛋白 . PMLRAR和 PLZFRAR两种融合基因的产物均能阻断维甲酸信号传导通路，但二者对全反式维甲酸(alltrans retinoic acid, ATRA)的反应却表现出明显不同，即表达PMLRAR的
10、 APL 患者对 ATRA 敏感，而表达 PLZFRAR的患4者对 ATRA 不敏感. ATRA 和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）曲古菌素 A(trichostatin A, TSA)联合治疗可以诱导 PLZFRAR阳性 APL 细胞发生分化1. 我们利用建立的 PLZFRAR融和基因在小鼠髓系细胞特异表达的hCG PLZFRAR转基因鼠 (transgenic mice, TM)模型，在生物水平研究了 TSA 联合维甲酸对 PLZFRAR 阳性白血病细胞的诱导分化作用. 1 材料和方法 1.1 材料 TM 的建立参照文献 2
11、. 本研究所已经构建了hCGPLZFRAR载体，将此质粒转化大肠杆菌，氨苄青霉素 LB平板筛选出阳性克隆，获得的质粒经酶切及测序验证后，用Qiagene 纯化柱大量提取质粒，经 SalI, PvuI 酶切完成质粒线形化，纯化得到转基因构件. 将转基因构件显微注射到受精卵雄原核，植入假孕母鼠，小鼠出生后 2 wk 进行整合鉴定. SPF 级 C57BL/6J, B6DBA 小鼠由上海南方模式生物研究中心繁育，获得的 TM 在上海第二医科大学动物科学部 SPF 级动物房饲养. TSA (Sigma)溶解于无水乙醇， 配成 1 g/L 储存液, 用时以培养液稀释成 10 mg/L 工作液. ATRA
12、 (Sigma)溶解于无水乙醇, 配成 10 mmol/L 储存液, 用时以培养液稀释成 100 mol/L工作液. 1.2 方法 1.2.1 基因整合检测参考文献方法2进行基因整合的检测. 剪取 TM 的尾巴约 1 cm，抽提得到基因组 DNA，紫外分光光度计5测定 A 值并定量，每次反应以 100 ng DNA 为模板运用 PCR 对PLZFRAR TM 基因整合进行检测. 取反应产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察，摄片. 取全部基因组 PCR 鉴定阳性的 G0 代TM 进行基因组 Southern blot 分析，BioRad 磷屏放射自显影12 d 后扫描，所得结果根据条带大小确定
13、融合基因是否整合到小鼠基因组中. 1.2.2RTPCR检测 TM 中 PLZFRAR的表达颈椎脱臼法处死小鼠，用 RPMI1640 (Gibco)培养液冲洗小鼠股骨及胫骨收集骨髓细胞，Trizol 抽提细胞总 RNA. 紫外分光光度计 (Beckman DU600)对 RNA 定量并检测 A260/A280 鉴定其纯度，10 g/L 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳判断 RNA 的完整性，RTPCR 检测PLZFRAR融合基因 . 由于所检测的融合基因 PLZFRAR是cDNA，为避免基因组 DNA 污染造成的假阳性结果，所设计的引物跨越了载体 hCG 的第一个内含子. 取反应产物行 12 g/L 琼脂
14、糖凝胶电泳，紫外灯下观察，摄片. 1.2.3 免疫荧光检测融合蛋白表达取 TM 骨髓或脾脏细胞，涂片，-20 预冷甲醇/丙酮 (11)固定液浸泡固定 510 min, PBS 浸洗，30 g/L BSA 封闭，一抗(goat antiPLZF, Santa Cruz)室温孵育 1 h，PBS 洗 5 min5 次，二抗(FITCrabbit antigoat IgG) 室温孵育 1 h，PBS 洗 5 min5 次，碘化丙啶(PI) 复染，封片，激光共聚焦显微镜下观察. 1.2.4 小鼠血象、骨髓象、脾脏细胞形态学及病理检查鼠尾采6血，测血象；制备外周血涂片，WrightGiemsa 染色，显
15、微镜下观察细胞形态并计数白细胞分类. 颈椎脱臼法处死小鼠，RPMI1640培养液冲洗股骨及胫骨，取得骨髓、脾脏细胞，用 PBS 冲洗， WrightGiemsa染色，显微镜下观察细胞形态，计数 200 个细胞得出有核细胞分类. 取小鼠肝脏、脾脏、胫骨及肺脏，石蜡包埋，作 HE 染色，镜下观察病理变化. 1.2.5 骨髓细胞的收集培养和检测无菌操作取小鼠骨髓细胞，加入红细胞裂解液(Sigma)去除成熟红细胞，PBS 洗涤 2 次，细胞悬浮于含 100 mL/L 胎牛血清(Gibco) 的 RPMI 1640 培养液中, 在含 950 mL/L 空气: 50 mL/L CO2 的 37饱和湿度环境
16、下培养. 在培养基中分别加入 1 mol/L ATRA 和/或 5 g/L TSA，培养 12 h后收集细胞，离心涂片（500 r/min, 5 min） ，WrightGiemsa 染色，显微镜下观察细胞形态，计数 200 个细胞得出有核细胞分类. 取约 1106 细胞，PBS 洗涤，750 mL/L 冷乙醇 4固定过夜，PBS 清洗，加入 Rnase (终浓度 200 mg/L)消化， 20 mg/L PI 染色，孵育 30 min，用流式细胞仪(BeckmonCoulter, Miami, Florida)检测细胞不同 DNA 含量分布，经 Multicycle 软件分析细胞周期和凋亡细胞. 取细胞悬液 100 L（约含 5105 细胞） ，加入FITC 或 PE 标记的抗体，流式细胞仪检测
