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1、1正交设计编程及科研应用实例作者：成微 储成顶 王世亮 俞敏鲍玉婷 马晓芹【关键词】 正交摘要：目的：在科研工作中推广应用正交设计方法。方法：以 VBA 语言自编正交设计软件模块，加载于 ECXEL 平台，并予以剖析及实例应用。结果：程序能准确选定考核指标，进行直观和方差分析，给出试验的优选方向和“可能好配合” 。结论：该软件模块运用方便，可正确使用公认准测进行数据处理。关键词：正交设计；因素；水平；直观分析；方差分析 在科研实验例如新药研究领域，探索配方，论证方法，均需对诸多影响因素及水平作出比较选择。这种选择试验的巨大投入，往往成为许多研究者的困惑。此时，合理的正交设计，就可能是解困的关键
2、14 。基于此，笔者一直探索在微软 EXCEL 平台编制和应用正交试验软件模板5 ，现报道如下。当然，相对于权威统计软件 SAS 这一 “摩天大厦” ，笔者只是试建一个“小便利店” 。对一般性任务用户而言，后者不止是方便，更因其有人人熟悉的“一元化”界面及无需前期学习的特点而在实2际上促进了统计理论在药研工作中的理解和推广。据笔者经验，药研试验中最多见的当是 27 个因素、23 个水平的优选。因此在该软件的 10 版本中，我们仅设计 4 个正交表头模板 ： L8(27)、L9(34) 、L16(215)、L8(424)(混合水平表)，分别在 sheet14 之间安排。同时为了满足部分用户的更高
3、要求，在sheet5 以后的表中，另设计含有交互作用处理的正交处理模板：L8(27)、L9(34)。1 正交模板程序流程模板流程为完全模仿试验者的实际需要步骤，以一个条件优选试验为例：首先是试验者提出计划设定因素及水平，接着由模板 确定试验项目详细安排试验实施表，然后试验者按图索骥进行条件水平试验，最后将试验结果再输至模板中，由程序进行各种分析，最终给出试验的优选参数或方向。因此，各模板都将具有以下 6 块结构并自动协调执行：11 正交设计表头向用户提共正交设计的规范表头。312 设定因素及水平显然，这是一个试验参数输入区，即设定的因素及水平值。输入后程序即自动在下面13 块中生成试验实施表。
4、13 试验实施表及试验数据研究者可按试验实施表组织试验，并于试验后输入正交试验结果。点击处理图标后，程序即进行自动运算。由于本块为试验实施表，含有各因素列的有序排列，故相应增加若干行，用来显示对正交结果的直观分析，如此使模板界面更加整洁。14 方差分析表无须赘言，这是本模板的精髓所在。15 中间参数因正交试验结果的直观和方差分析均需要一些中间数据，就列放于本块之中。此外，在本块的适当醒目位置，另设有一些幽默的提示语言栏及小动画设置，告诉用户操作中的失误或指导进行某4步的操作。当然，作为一个软件界面，还附加了一些诸如时间、次数、备份资料等一些有用的信息。16 程序校验此块是隐藏的，并不显示于模板
5、界面上。根据笔者经验，任何程序都难免遭受病毒攻击，故从 SAS 分析实例中精选一批数据，当激活检验图标时，这些数据将以只读形式输至本模板，并予处理，处理结果(包括大量中间参数) 与预存数据比较，从而判断模板是否出错并提供信息。2 部分编程处理原则或原理模板制作采用 VB 语言后台编程和前台 EXCEL 公式构建相结合的方式。部分编程原理是：21 试验结果的判断指标的处理正交试验的观察指标(即试验结果) 往往不止一套，各自的判断(或考核 )指标也不会一样，程序将视以下几种情况分别处理并在提示栏公布信息和指标方法：以大为优时(例如考核试验结果的回收率)，试验者应在模板指定位置处( 在该结果数据列的
6、下方) 填上5“max”或 “大”字符，程序读取后，即按正常模式进行处理。以小为优时(如考核试验结果的精密度值 RSD)，则应填为“min”或“小” ，模板会将数据 x 作倒数变换成 1/x 后处理。以某定值d 为优时，则应填上这个定值 d，模板会将数据 x 按公式 1/(x-d)2变换。以远离某定值 d 为优时，则应分别填上： d(越大越优)，d(双向远离均优)，模板会将数据 x 择下述公式之一变换：(x-d);(d-x)或(x-d)2。显然经此变换后，内部的分析程序就可统一按以大为优原则处理数据。模板的 10 版本上共设有 4 列试验结果列，允许用户输入并同时自动处理 4 套结果数据。若无
7、 4 套结果，可以空置。程序读到空白列时即自动跳过此列，并在提示栏公布信息。22 试验结果的直观分析直观分析的原理在此不赘述，读者可参阅相应的统计书籍。直观分析图对 EXCEL 来说是易如反掌。但程序试用后，有用户反映图似多余，现 10 版本中予以删除。当然，直观分析图所展现的优选趋势，程序中已作相关的运算：除提示“可能好配合”外，凡是优选水平为中间值的，模板会提示“似在附近” ；而优选水平为高低限的，则会提示“似为更高”或“似为更低” 。此种处理，经部分药研工作者试用，反映较好。623 试验结果的方差分析方差分析的原理亦不赘述，读者亦可参阅书籍。方差分析是调用 EXCEL 自身集成的方差分析
8、模块，并在本模板中巧妙组合。方差分析结果可提示因素的显著性和重要性，用以结合直观分析结果而共同确定最优水平。24 试验结果的最终优选综合程序确定的原则是：对于由方差分析提示的重要因素，其水平就取直观分析建议的优选水平，按其取优或建议补做进一步试验。对于方差分析提示为不显著或最不重要的因素，优选水平的确定由用户根据节约、高效、方便的原则自行确定。当然，程序仍给出“可能好配合”的建议。25 试验结果的交互作用分析交互作用的分析原理仍不赘述。在可分析交互作用的模板内，程序按通用规则进行处理，并兼顾直观和方差分析的结果，对所有的交互作用作显著性判断，最终对各交互作用的重要性排序并予提示性输出，并将交互
9、作用考虑进最终的优选方向推荐中。7作为数据处理应用系统，该软件已加载于安徽医科大学实验管理系统中，本研究第一作者可免费提示该程序离线用户版。3 药研应用实例甲氨蝶呤缓释体内植入剂的体外释放方法研究31 体外释放试验及测定方法体外释放试验方法为等距浸出法/换液杯法。按此方法试验，其释放模型经理论及试验证明，与杯法完全一致(已另文发表)5 。体内吸收率与体外释放度的关联按中国药典 2000 年版规定的“点对点相关”方法试验和检验(已另文发表) 6 。此前测知：甲氨喋呤稀溶液约稳定 5d(变异系数 CV5%)，故确定释放介质每 4d 更换 1 次。取样时间点为： 2h,8h,24h,48h,72h,
10、96h(第 1 次换液)，144h，192h( 第 2 次换液)，240h,288h(第 3 次换液)，384h。测定方法为 2000 年中国药典甲氨蝶呤项下方法。32 正交试验及因素水平选择影响体外释放的因素较多，一些是不容改变的，例如温度370.5。可选择改变的重要因素有 4 个：释放介质 (种类)、介质浓度、介质体积及搅拌转速，设计为四因素三水平的正交优选试验。根据我们的实践，该四因素间交互作用较小(仅介质种类和浓度间可8能有微弱的交互作用，而选择适当时亦可使浓度因素近似成为独立变量)，故以正交表 L9(34)实施，以减少试验工作量。321 介质种类及水平的选择 该制剂的辅料为可降解型聚
11、 L 乳酸。针对其特点，介质种类重点考虑介质的酸碱性：选酸、中及碱性 3 种，即 pH 值分别为6、7 及8 的二元缓冲溶液。322 浓度因素及水平的选择 对应地，浓度因素的类型定为等渗比例(稀释)浓度，而不选摩尔浓度和一般的质量|体积浓度。因后两者的同一水平对不同的介质有相对复杂的不同效应，但等渗比例浓度不然，同一水平有相同的渗透压(当然，稀释后为非等渗液) ，并不论介质如何变化。特别地，渗透压又可能是影响药物体内释放与吸收的重要因素。323 浓度水平的选择 并不选 0 水平即纯水。因该水平将导致因素(介质种类) 差异消失，不符合正交设计的初衷。实际设计为 100%(等渗液) 、25%(等渗
12、液 +水=1+3)、10%(等渗液+水=1+9)的比例等渗浓度。9为了不漏掉对水介质影响释放的观察，在上述正交试验后，以优选的其他因素水平，另做以纯水为介质的试验。324 介质的体积及水平选择 以确保体外释放漏槽效应为前提而确定之：每试验杯/瓶投药1 包装量( 甲氨蝶呤 5mg)，介质体积水平分别取100、 200、 500mL。325 搅拌转速及水平选择 参照 2000 年中国药典释放度项下规定，选转速水平为0、50 、100r/min。33 正交试验结果(考核指标) 的优选认定缓释制剂的体外释放是比较复杂的试验，其结果的优选判断亦很不易。我们选择的是综合考虑以下 3 套：331 各试验结果
13、的拟合模型及拟合优度 模型为一级或 Higuichi 方程，拟合优度以相关指数与残差平方和之商(记作 R2/Mse)衡量之，以大为优。10332 各试验结果的精密度 各试验做 3 份平行样，求得各时间点的精密度(相对标准偏差RSD)和所有时间点的平均 RSD，以小为优。为便于文中展示，求其倒数后输入(记作 1/RSD)，仍以大为优。333 各试验达 75%释放度的时间 以靠近 10d 为优(注：若考虑减小试验工作量，当采用适当的体外释放介质，使体外释放周期明显小于其标称体内缓释期。但据此前大量试验，若两者不同，体内外相关较难。故择相近的释放周期：以约 10d 达到 75%释放度为优选目标)。该
14、数据可按拟合模型求算，即取所得释放曲线上对应于 75%释放度的天数 d。按定值d 为优方式，将此天数减 10 后平方再取倒数值(记作 1/(d-10)2)，以大为优。34 试验结果341 正交试验数据正交表头的设计见表 1，正交试验的结果见表 2。表 1 正交11表头 L9(略)表 2 正交试验结果（略）表 3 方差分析结果（略） 关于释放介质 从试验结果看，3 类结果均显示释放介质是显著性因素，可能好水平为 pH8。这符合该试药的特点。因辅料是聚 L 乳酸，它的高分子链端基因当然与稀碱溶液相容更好，故在碱性介质中的释放也相对最理想。试验中观察到：中或酸性的介质均导致释放偏慢，释放后期所取的样
15、液浓度小，误差大，这亦是 RSD 变差，拟合优度下降的合理解释。 关于介质浓度 它的重要性仅在试验结果 1/(d-10)2 的分析中被提示，在另两类结果中均为最不重要因素。故就取被提示的可能好水平。试验中观察到：对被优选的碱性介质而言，浓度与释放速度成增函数关系，当介质浓度是 100%时达 75%释放度的时间是 6d 左右，而 10%时达 75%释放度的时间是 13d 左右，以 25%(约 10d)最符合我们的期望。 关于介质体积 123 类结果均提示介质体积在 200 以下，其中试验结果R2/Mse 提示为影响较显著，可能好配合为 200。考虑到此体积并不算太大，试验中所取样液的浓度也较合适
16、，就取此值为释放介质的体积。 关于搅拌转速 无须赘言，就取试验结果 1/RSD 的分析所提示的可能好水平50r/min，这也恰是 3 个水平中的中值。参考文献1 周同惠，汪尔康，陆婉珍分析化学手册 第一分册北京：化学工业出版社，1999，62363;694706.2 Kathy Ivens, Conrad Carlberg. Excel 2002:The complete Reference(M). Beijing:China Machine Press,2001,3694513 Charles. Stone. A Course in Probability and Statistics. Beijing: China Machine Press, 2003,628672.134 陈魁应用概率统计北京：清华大学出版社，2003,262301.5 王世亮，储成顶，刘飞，等一种新的长效制剂体外释放方
