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1、1早期肌肉特异性 mRNA 在骨髓干细胞的表达作者：曾缨，张成，李才明，柳太云【关键词】 骨髓祖代细胞；组织特异性；肌形成调节因子Expression of early muscle specific mRNA in bone marrow stem cells【Abstract】 AIM: To study the expression of early muscle specific mRNA in bone marrow stem cells. METHODS: The expression of early muscle specific mRNA, including MyoD, M
2、yf5, myogenin, MRF4 and desmin, in bone marrow stem cells of C57 mice of different phases and SD rats of different generations was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). RESULTS: In different cultured phases (day 0,2,7) of C57 mouse bone marrow stem cells, RTPCR analysis
3、 showed the presence of Myf5 and desmin, whereas MyoD, myogenin and MRF4 were not detected. In different generations (from the primary to the 6th generation) of rat bone marrow mesenchymal stem cells, MyoD and desmin were detected, whereas myogenin 2and MRF4 were not detected by RTPCR analysis. CONC
4、LUSION: Bone marrow stem cells can express early muscle specific mRNA to some extent.【Keywords】 myeloid progenitor cells; tissuespecificity; myogenic regulatory factors【摘要】 目的： 研究早期肌肉特异性 mRNA 在骨髓干细胞中的特异性表达. 方法： 利用 RTPCR 研究不同时期 C57 鼠和不同代龄 SD 大鼠骨髓干细胞早期肌肉特异性 mRNA（包括 MyoD, Myf5, myogenin, MRF4 和 desmin）
5、的表达. 结果： Myf5 及desmin 在新鲜分离、培养了 2 d 和 7 d 的悬浮与贴壁的 C57 小鼠骨髓干细胞中均有表达，没有检测到 MyoD, myogenin 和 MRF4在此时期小鼠骨髓干细胞的表达. MyoD 与 desmin 在原代至第 6代 SD 大鼠骨髓间质干细胞中均有表达，没有检测到 myogenin 和MRF4 在各代细胞中的表达. 结论： 骨髓干细胞能表达一定水平的早期肌肉特异性 mRNA.【关键词】 骨髓祖代细胞；组织特异性；肌形成调节因子0 引言3在不同的诱导条件下，成体造血干细胞可分化形成脑的星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞，肌细胞和肝细胞等，骨髓间
6、质干细胞在体内外也可分化为肝、软骨、脂肪、骨、肾、肌腱、脑和肌细胞等1-2 . 目前对骨髓干细胞可塑性的研究很多，而且对骨髓干细胞表达抗原的研究普遍集中在对其表面抗原表达的研究方面，而对组织特异性抗原在未分化骨髓干细胞的表达的研究报道却较少3. 我们的研究旨在探讨肌肉特异性抗原 desmin 和成肌调节因子（myogenic regulatory factors，包括MyoD，Myf5，myogenin 和 MRF4）在骨髓干细胞的表达情况.1 材料和方法1.1 材料大鼠骨髓干细胞（ rMSC）和小鼠骨髓干细胞(mMSC)分别取自 SD 鼠和 C57BL/6J 鼠的股骨与胫骨骨髓；正常SD 鼠
7、和 C57BL/6J 鼠购于中山大学中山医学院实验动物中心，体质量分别为 100 g 和 20 g，雄性. DMEM， F10 干粉培养基，胰蛋白酶粉剂，RTPCR 试剂盒（ThermoscriptTMRT） ，Trizol （美国Gibco） ；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）(美国 Hyclone 公司） ；DEPC（美国 Sigma 公司）. 所选用或设计的 RTPCR 引物均至少跨越 1 个外显子，这就避免了因 DNA 污染而产生假阳性的可能性. 所有引物均由上海生工合成（表 1） .41.2 方法1.2.1rMSC 的分离与原代培养乙醚麻醉 SD 鼠，置 7
8、00 mL/L 乙醇消毒 1 min，超净工作台无菌条件下取出后肢股骨与胫骨，断开骨端，将骨髓细胞冲至盛有含 100 mL/L FBS 完全培养液的无菌小烧杯中，900 r/min 离心 10 min，用含 100 mL/L FBS 的培养液悬浮沉淀细胞，接种至培养瓶，放置 50 mL/L CO2, 37,饱和湿度的 CO2 培养箱中静置原代培养 .1.2.2mMSC 的分离与原代培养 mMSC 的培养基为含 200 mL/L FBS 的 F10 与 LDMEM 培养液，余同 rMSC.表 1RTPCR 引物（略）1.2.3rMSC 的传代待上述 rMSC 贴壁细胞接近 80%90%融合时，用
9、 2.5 g/L 胰酶 37消化，加入含 100 mL/L FBS 的培养液终止消化，收集细胞，900 r/min 离心 10 min，用含 100 mL/L FBS 的培养液悬浮沉淀细胞，将细胞悬液以 12 或 13 分配比例接种传代， 23 d 换液 1 次，倒置相差显微镜下逐日观察、记录并照相.1.2.4MyoD, Myf5, myogenin, MRF4 和 desmin 的 RTPCR5检测提取细胞总 RNA，ThermoScriptTM 逆转录，PCR 扩增，反应体系为：10 mmol/L dNTP 1 L, 10buffer 5.0 L, 引物（10 mol/L）上游 2.0 L
10、，下游 2.0 L，样品 cDNA 2.0 L，Tag 酶 1 L（16.67 nkat） ，反应总体积 50 L；反应条件为： 94预变性2 min94变性 1 min5968退火 1 min72延伸 1 min（30 个循环） 最后 72延伸 10 min4 保存. 之后用 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后置凝胶自动成像仪拍照记录.1.2.5mMSC 表面标志物的检测收集培养了 2 d 的小鼠骨髓干细胞的悬浮部分，PBS 洗涤 3 次，加入饱和浓度 FITC 荧光标记的大鼠抗小鼠 CD34FITC 抗体，室温下避光孵育 3045 min，PBS洗涤， FACScan 流式细胞仪
11、检测细胞表面抗原的表达；再用破膜剂破膜，40 g/L 多聚甲醛固定 15 min，加入饱和浓度 PE 荧光标记的小鼠抗小鼠 desmin 抗体，室温下避光孵育 3045 min，PBS 洗涤，FACScan 流式细胞仪检测细胞质内 desmin 抗原的表达.2 结果2.1C57 小鼠与 SD 大鼠骨髓干细胞的体外培养 C57 小鼠骨髓干细胞的悬浮细胞（骨髓造血干细胞）和贴壁细胞（间质干细胞）均在离体培养约 1 wk 内迅速增殖，之后基本处于停滞状态，用一般的培养基（如 DMEM, F10）培养无法对 C57 小鼠的骨髓间质干细胞进行传代，因为传代后细胞基本不增殖. 而 SD 大鼠的原代悬浮6细
12、胞在离体培养 3 d 内就迅速增殖，贴壁细胞潜伏期相对较长，一般 1014 d 可传代，生长快的 7 d 就可传代，传代后细胞的生长潜伏期明显缩短，一般每 3 d 可传 1 代，生长快的 12 d 就可传代. 随着传代次数的增加，增殖速度逐渐减慢.2.2 成肌调节因子和 desmin 在不同时期小鼠骨髓干细胞的表达对新鲜分离（p0） ，培养 2 d 和 7 d 的悬浮、贴壁 C57 小鼠骨髓干细胞（分别以 S2, A2, S7, A7 表示）成肌调节因子和 desmin的 RTPCR 检测显示：Myf5 和 desmin 在以上各期细胞中均有表达，没有检测到 MyoD, myogenin 和
13、MRF4 在这些时期小鼠骨髓干细胞的表达（图 1）. M: 100 bp 梯度分子量标准，最亮的条带代表 500 bp；p：阳性对照；p0: 新鲜分离干细胞；S2: 培养 2 d 悬浮干细胞；A2 ： 培养 2 d 贴壁干细胞；S7：培养 7 d 悬浮干细胞；A7： 培养 7 d贴壁干细胞.图 1Myf5 与 desmin 在不同时期小鼠骨髓干细胞的表达（略）2.3 成肌调节因子和 desmin 在不同代龄大鼠骨髓干细胞的表达 MyoD 与 desmin 在原代至第 6 代 SD 大鼠骨髓间质干细胞中7均有表达，没有检测到 myogenin 和 MRF4 在各代细胞中的表达（图 2）. M：5
14、0 bp 梯度分子量标准，最亮的条带代表 350 bp；p0 ： 新鲜分离干细胞；p1p6： 分别为分离 1, 2, 3, 4, 5 和6 d 干细胞.图 2MyoD 与 desmin 在不同代龄大鼠骨髓干细胞的表达（略）2.4 骨髓干细胞表面标志物的检测利用流式细胞仪采用双染的方法发现培养 2 d 的 C57 小鼠原代悬浮细胞中存在 CD34 与desmin 共阳性细胞（图 3）.A： 筛选细胞；B： 设置阴性对照； C： 检测 CD34 与desmin 共阳性细胞.图 3 流式细胞仪检测 CD34 与 desmin 共阳性细胞3 讨论作为转录因子的成肌调节因子调节着脊椎动物骨骼肌的决定8和
15、分化4 ，把转录因子转移入骨髓间质干细胞的转基因与干细胞移植相结合技术已成为治疗疾病的新思路5.我们的研究表明，对于新鲜分离、培养了 2 d 和 7 d 的悬浮、贴壁 C57 小鼠骨髓干细胞来说， Myf5 和 desmin 在以上各期细胞中均有表达，我们没有检测到 MyoD, myogenin 和 MRF4 在这些时期小鼠骨髓干细胞的表达. 这说明骨髓干细胞的悬浮和贴壁细胞组分都能表达一定水平的早期肌肉特异性 mRNA. 在肌肉发生过程中 Myf5 是最早表达的成肌调节因子 . 我们的研究结果与 Corti 等6的研究结果近似，所不同的是后者还在以上各期细胞中检测到MyoD 的表达，他们还用
16、免疫细胞化学方法发现在新鲜分离的 C57小鼠的骨髓干细胞中存在 desmin 与 CD34 共阳性的细胞，我们改进了方法，利用流式细胞仪采用双染方法证实培养了 2 d 的 C57 小鼠的悬浮骨髓干细胞中存在 CD34 与 desmin 共阳性细胞，从而验证了他们的发现. Gussoni 等7的研究就已表明骨髓造血干细胞移植入动物体内后能转化为肌细胞. 张为西等8用全骨髓细胞、造血干细胞和间质干细胞移植治疗 mdx 鼠时， dystrophin 表达率分别为 7%, 6%和 4%.对成肌调节因子和 desmin 在 SD 大鼠不同代龄骨髓间质干细胞的表达的研究表明，MyoD 与 desmin 在原代至第 6 代骨髓间质干细胞中均有表达，没有检测到 myogenin 与 MRF4 在各代细胞9中的表达. 这说明大鼠骨髓间质干细胞也能表达一定水平的早期肌肉特异性 mRNA. Ratajczak 等9用 R
