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1、肠杆菌科细菌鉴定,实验目的,掌握肠杆菌科细菌的基本特征和鉴定程序掌握肠杆菌科细菌分类的鉴别试验,菌种,埃希氏菌属：大肠志贺氏菌属：福氏，宋内氏变形杆菌属：普通变形克雷伯菌属：肺炎沙门氏菌属：伤寒、PA，PB,肠杆菌鉴定程序,实验内容,按检验程序操作（每人一种菌，8人一组）：1、制作SS平板培养基(成分,原理见下一页)2、在SS平板上分离接种各菌(大:红色菌落;其它为无色透明)3、接种肠杆菌科生化：KIA，半固体（M），蛋白胨水（I），尿素（U），葡胨水（Mr），枸橼酸盐培养基（C），苯丙氨酸培养基4、做GS染色,SS平板培养基:选择性培养基,有促进目的菌生长的物质和鉴别用指示剂.1煌绿、胆盐、
2、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制G+菌及大多数大肠生长，胆盐促进伤寒生长。2大肠分解乳糖产酸：中性红（6.8红8.0黄）变红，与胆盐结合合成胆酸，因而形成中心混浊的深红色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落呈透明微黄色。3枸橼酸铁能指示硫化氢产生，硫化铁呈黑色4硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用，并中和煌绿、中性红染料的毒性，使大肠红色鲜明,动力试验：原理：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长。培养基：半固体培养方法：分别穿刺接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，37 孵育16-18h结果：穿刺线扩散，培养基透明度减低为动力阳性；穿刺线清晰，培养基透明为动力阴性。大肠+，肺杆-。,吲哚试验：（
3、靛基质试验）原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛形成红色化合物。培养基：蛋白胨水方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，37 孵育16-18h结果：取出后，滴加吲哚试剂2d，混匀，可见培养物上层呈玫瑰红色为+，不变色为- 大肠+，伤寒-,尿素酶试验：原理：产生尿素酶的细菌能分解尿素，形成氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变成红色。培养基：尿素培养基方法：将大肠埃希菌和变形杆菌分别接种于尿素培养基中，37 孵育16-18h结果：培养基变红色者为阳性。变黄为阴性。 大肠-，变形+,甲基红试验：原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一
4、步分解为甲酸、乙酸等，故培养物pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色。有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为其它物质，如醇、酮等，培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色。培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌结果：加入甲基红指示剂2d，混匀，红色为阳性，黄色为阴性。大肠+，肺杆-,苯丙氨酸脱氨酶试验：原理：某些细菌（如变形杆菌属），可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形成 绿色化合物。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 孵育16-18h结果：滴加100 g/L三氯化铁试剂，出现绿色为
5、+，不变为-。变形为+，大肠为-。,柠檬酸盐利用试验：原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用柠檬酸钠作为唯一碳源时，可在柠檬盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为柠檬酸盐利用试验阳性。若不能利用则不能生长，培养基不变色，为阴性。培养基：西蒙柠檬酸盐培养基方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 孵育16-18h结果：大肠-（绿色），变形+（蓝色）,结果判断,KIA：观察上部和下部的颜色变化，变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气，有黑色为产硫化氢。动力（M）：半固体上沿穿刺线生长，周围清澈，为阴性，周围混浊者为阳性 。吲哚（I）：-
6、在蛋白胨水中滴加靛基质试剂2-3滴，立刻变红者为阳性，不变为阴性。尿素酶试验（U）：变为深粉红者为阳性，不变或变黄者为阴性。甲基红试验（Mr）：-在葡胨水中滴加甲基红试剂2-3滴，变红为阳性，变黄为阴性。枸橼酸盐利用试验（C）：细菌在上生长，颜色变为蓝色为阳性，细菌不长或培养基颜色不变为阴性。苯丙氨酸酶试验：-在斜面上滴加试剂滴，变成暗绿色为阳性，不变为阴性。,KIA 用酚红作指示剂（ 6.8黄8.4红），1细菌如能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则斜面及底层均呈黄色，且有气泡。2如只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因 葡：乳为1：10，斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色
7、，底层同于是在相对缺氧的状态下，所生成的酸不被氧化挥发而保持黄色。3如细菌分解蛋白质产生硫化氢，则成硫化亚铁生成硫化铁黑色沉淀物，使培养基变黑。4接种方法：先穿刺到底，再在斜面划线。,结果观察,细菌名称 KIA M I U Mr C 苯丙氨酸大肠 A/A + + - + - -福氏 K/A - - - +/- - - 宋内氏 K/A - - - + /- - -伤寒 K/A + - - + +/- -PA K/A + - - + - - PB K/A + - - + + - 肺克 A/A - - - - + - 变形 K/A + + + + +/- +,志贺氏菌属血清凝集,四种多价血清（NS对照） 凝集 福氏多价血清凝集 宋内氏多价血清凝集 福氏志贺菌 宋内志贺菌,沙门菌属血清学凝集,A-F多价“”血清（对照）凝集单价血清血清型菌名 PA甲 PB乙 丙 伤,
