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1、1不同转移潜能骨肉瘤细胞株的建立与生物学性质的分析作者：陈翔，杨彤涛，马保安，范清宇 【关键词】 骨肉瘤Establishment of human osteosarcoma cell sublines with different potential of metastasis and studies on their biological characteristics【Abstract】 AIM: To get human osteosarcoma cell subclones with different potential of metastasis. METHODS: We got
2、 different monocell clones by the limited dilution method from the human osteosarcoma cell line SOSP9607. After preliminary screening by in vitro invasion assay, we selected two cell lines as high metastasis potential cell subclones and three cell subclones as low metastasis potential cell subclones
3、. We inoculated these subclones into nude mice for three circles and obtained different metastatic potential subclones. We then inspected their different biological properties by tests of cell growth curve assay, 2chromosome number, soft agar cloning technique, flow cytometry and auto metastasis in
4、nude mice. RESULTS: We got the two subclones with the different metastasis potential: low potential subclone H9 and high potential subclone E10. They had the same hypotriploid karyotype with human chromosome morphology. E10 had faster growth speed than H9 and the artificial lung metastasis rate of H
5、9 and E10 in nude mice was 10% and 100%, respectively. The rate of S phase cell cycle was respectively 16.8% and 21.0%. CONCLUSION: These two subclones come from the same mother cell line and their difference mainly lies in the different metastatic phenotype. This study will help the screening of me
6、tastasis correlated gene, the study of the metastatic mechanism and clinical study of osteosarcoma.【Keywords】 osteosarcoma；neoplasm metastasis；cell subclone；biological specialties【摘要】 目的：获得不同转移潜能的骨肉瘤细胞株. 方法：从我室建立的人成骨肉瘤细胞系 SOSP9607 中通过有限稀释法获得不同的单细胞克隆，经过侵袭试验初筛后获得 5 株转移潜能不同的细胞株，再通过裸鼠体内连续传代法筛选出具有不同转移能力的
7、细3胞系. 并利用细胞生长曲线测定，软琼脂克隆形成试验，流式细胞仪，裸鼠体内自发转移试验分析了他们的生物学性质. 结果：获得两株转移潜能不同的骨肉瘤细胞株.其中,H9 为具有低转移潜能的骨肉瘤细胞株, E10 为具有高转移潜能的骨肉瘤细胞株，其染色体众数分布特征与母系 SOSP9607 基本相似，保持人类染色体核型；所至皮下移植瘤及肺转移瘤均符合人成骨肉瘤组织学特征，它们具有差异明显的体外生长速度，软琼脂克隆形成率 H9（225）明显高于E10(9812) ，裸鼠体内试验性自发肺转移率分别为 10%和100%，流式细胞仪测定 H9 和 E10 的 S 期细胞分别为 16.8%和21.0%. 结
8、论：这两株细胞株来源于同一亲本，他们之间的差异集中在转移表型上，为今后利用分子生物学的方法筛选出转移相关基因从而为成骨肉瘤的转移机制及临床研究奠定基础.【关键词】 骨肉瘤；肿瘤转移；细胞株；生物学特性0 引言肿瘤转移是一系列步骤组成的，包括侵袭周围组织，延血管或淋巴管运行、在靶器官上增殖等.自 Fidler1 提出肿瘤转移异质性概念后，国内外已相继有一些实验室建立了黑色素瘤，前列腺癌，肺癌的不同转移潜能的细胞亚系2-4.但从人骨肉瘤细胞中分离出具有不同转移潜能的肿瘤转移亚群的报道却不多见，这在一4定程度上限制了对骨肿瘤转移机制的深入研究.为了在分子水平对其进行比较研究，获得具有相同的遗传背景不
9、同转移潜能的肿瘤细胞株十分重要.1 材料和方法1.1 材料成骨肉瘤细胞系 SOSP9607 细胞系由第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所实验室建立；RPMI 1640(Gibco, USA),胰蛋白酶（华美生物工程公司） ；胎牛血清与小牛血清（兰州民海生物制品公司） ；细胞培养瓶与细胞培养板（Nunc，USA） ；基底膜胶（北京大学医学部细胞中心） ；侵袭小室（Milipore PI8P01250，USA） ；流式细胞仪（第四军医大学免疫教研室提供） ；BALB/cnu/nu 裸小鼠（上海思莱克动物试验有限公司） ；琼脂（Spain 兰州民海生物制品公司）.1.2 方法1.2.1SOSP960
10、7 的克隆化分离培养 SOSP9607 骨肉瘤细胞至对数生长期，用 2.5 g/L 胰酶消化，倒置显微镜下记数，梯度稀释至 4.6 mL 含 230 个细胞（每 0.1 mL 含 5 个细胞） ，加入 96 孔5板前 36 个孔，每孔 0.1 mL.还剩 1.0 mL，加培养基至 5 mL（每0.1 mL 含 1 个细胞）再加入相邻的 36 孔，每孔 0.1 mL.剩余 1.4 mL，再加培养基至终体积 2.8 mL， （每 0.1 mL 含 0.5 个细胞）加入剩余的 24 孔，每孔 0.1 mL.放入培养箱中，在 37 ，50 mL/L CO2，饱和湿度环境下培养 5 d，倒置显微镜下观察
11、有单细胞克隆生长，补充培养基继续培养，待长满孔底后消化移至 24 孔板，6 孔板，最后移至培养瓶中培养，得到单克隆的细胞株，分别命名为B7，B12 ，C2 ，C11，D12,E10,E12,F6,H4 和 H9.1.2.2 利用体外侵袭试验进行初筛将细胞培养至对数生长期后，用 2.5 g/L 胰酶消化，记数，加入 Millipore 中，每室 2105 个细胞数. 放入培养箱中常规培养 7 h，用棉签擦去侵袭膜上的瘤细胞和基底膜胶，甲醇固定 30 min，常规染色记数膜背面的细胞数，将其平均分为 4 个象限，每株细胞 3 孔，取平均值 .1.2.3 原位移植法在裸小鼠体内连续传代筛选转移细胞株
12、1.2.3.1 皮下移植瘤模型取对数生长期的细胞株，消化，记数5106/mL，取 0.2 mL（含 1106 个细胞）注射于 3 wk 龄裸小鼠股部及颈部皮下，2 wk 后开始有肿瘤生长，待长至 1.0 cm1.5 cm 后处死，将其剪成直径 0.5 mm 大小瘤块备用 .61.2.3.2 裸小鼠原位移植取 34 wk 龄裸小鼠，手术前每只裸鼠腹腔注射枸橼酸芬太尼（国产）和咪达唑仑（国产）混合液，每种药水用无菌药水稀释 1 倍后 11混合，每只裸鼠 0.2 mL.手术在清洁环境下进行，将裸鼠固定后，乙醇消毒，沿右胫骨表面剪开皮肤，皮下，剥离部分胫前肌，暴露胫骨平台，用皮试针头沿 45方向撬开一
13、骨片，将准备好的肿瘤碎片植入骨髓腔中，盖好骨片，用尼龙线全层缝合皮下、皮肤.1.2.3.3 体内连续传代 5 wk 后观察到肿瘤生长，待 10 wk 后处死全部裸鼠，如有呼吸困难，恶液质情况立即处死，取肺组织，肉眼观察及病理切片有肺转移者，留取肺组织中较大转移结节行原代培养并进行组织学观察，培养的细胞经 5 次传代后按上述办法进行第二次肺转移试验，共进行 3 个循环，第 3 次（肺转移率已达100%）从裸鼠肺转移结节原代培养获得的细胞为具有高转移潜能的肿瘤细胞株，相反的，肉眼观察及肺组织切片观察 3 次均不转移的细胞株为具有低转移潜能的细胞.然后连续扩大培养约 30 代，分别冻存.1.2.4
14、细胞生长曲线取两株相同代数细胞株培养至对数增长期，消化计数后，调整细胞数为 1105 个，接种至 25 mL 细胞培养瓶，每日任取 3 瓶细胞消化后计数，取其平均数，连续 7 d 后绘制细胞生长曲线.71.2.5H9,E10 与母系 SOSP9607 细胞染色体的制备染色体制备参照鄂征5所介绍的方法 .1.2.6 软琼脂克隆形成试验用三蒸水制备浓度为 12 g/L 的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，放于 40水浴锅中防止凝固 .按 11混合 12 g/L 琼脂糖液和 2DMEM（含 200 mL/L 小牛血清） ，取3 mL 上述液体注入直径 3.5 cm 的平皿中，冷却凝固.消化细胞制成悬液并计
15、数.按 11混合 0.7 mg/L 琼脂糖液和 2DMEM（含 200 mL/L 血清） ，在上述 3 mL 液体中加入 0.2 mL 细胞悬液（含 600个细胞）充分混匀，注入底层琼脂已凝固的平皿，冷却凝固.置 37孵箱中培养 1014 d，计录克隆形成数.1.2.7 裸鼠实验性肺转移率测定按常规分别消化培养瓶中的两株同代克隆细胞株，制成细胞悬液，经细胞计数后按每鼠 1105 细胞量在无菌环境下分别注入两组裸鼠（每组 10 只）的尾静脉.实验鼠均在接种瘤细胞后 1.5 mo 后处死，分别取出两组裸鼠的肺作全面的病理学检查，计算其转移率.1.2.8 流式细胞术测定细胞周期分布收集培养瓶中细胞，
16、PBS洗涤，用体积分数 750 mL/L 的冷乙醇固定.将细胞数调整在1105/mL 左右，溴化丙锭染色，上机检测.8统计学处理：数据用 xs 表示，采用 SPSS 10.0 软件进行数据处理，不同细胞株间比较采用方差分析及 SNKq 检验；H9 与E10 之间软琼脂克隆细胞数比较采用 t检验， P0.05 为有统计学意义.2 结果2.1 体外侵袭试验 10 个细胞株在侵袭试验中穿过侵袭膜的细胞数(xs)分别为 B7: (7812.4), H9: (9315.1), C2: (22130.5), C11: (21825.5), D12: (29620.2), E10: (40634.5), E12: (42836.5), H4: (27416.3), B12: (39832.2), F6: (22312.2)经方差分析及 SNKq 检验各细胞株可分为三组： B7 和 H9 为低侵袭组，E10，E12，B12 为高侵袭组，其余的为中侵
